【分析技术】SPR 表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance）的基本原理与应用

分子间相互作用强度和模式在药物研发中是衡量候选药物的重要指标。测量药物分子与靶标之间相互作用强度的方法有很多，包括NMR（核磁共振）、MST（微量热泳动）、ITC（等温滴定量热）、荧光偏振以及我们要介绍的SPR，表面等离子共振技术。

首先为大家介绍SPR技术的基本原理。SPR现象早在1902年由Wood发现，他观察到当电磁波射向金属表面时，其反射光谱会产生异常，表现为在特定角度下反射光强度明显下降，光谱上出现明显的暗带。而且金属膜表面折射率的变大会导致暗带位置发生变化。

直到1968年才对此现象提出了合理的解释。SPR现象来源于消逝波和金属表面等离子波的共振。在光从光密介质射向光疏介质时，在入射光满足一定条件时会发生全反射现象。当以波动光学的角度来研究全反射时，当入射光到达界面时并不是直接产生反射光，而是先透过光疏介质约一个波长的深度，再沿界面流动约半个波长再返回光密介质，而光的总能量没有发生改变，则透过光疏介质的波被称为消逝波。由于金属中含有自由电子气，可以看作一种等离子体，入射光激起电子气的纵向振动，振动产生的电荷密度波，沿着金属和电介质的界面传播，形成表面等离子波。金属表面等离子波与消逝波发生共振时，检测到的反射光强度会大幅度地减弱。当入射光波长固定时，反射光强度是入射角的函数，其中反射光强度最低时所对应的入射角为共振角（Resonance Angle）。表面等离子共振（SPR）对附着在金属薄膜表面的介质折射率非常敏感，当表面介质的属性改变或者附着量改变时，共振角将不同。

上图中展示的是SPR芯片工作原理， 这里的SPR芯片指的是一个带有葡聚糖（Dextran）的金属表面（Mental Surface），而配体蛋白（Ligand）的氨基端可以与葡聚糖结合从而被固定到金属表面。下方光源发出的一个单波长激光束进入到棱镜（Prism）中，导致多角度的光线入射到金属表面，几乎所有入射的光线都会发生反射，但有一个例外，在入射角达到某一个角度时，光子的能量会被金属吸收转化成表面等离子体波，在这个角度没有光线被反射出来，而是以很小的强度被检测器检测到，这个角度被称为共振角。由于等离子体波会在金属表面传播，所以金属表面偶联的配体蛋白与任何物质（这里固定的叫做配体ligand而流动相里面不是ligand叫做analyte）发生相互作用都将导致共振角发生改变。而共振角的该变量与Ligand-Analyte的数量成正比。因此，依据共振角的改变可以得到热力学的亲和常数Ka。

SPR分析周期包括以下几个阶段：第一阶段，baseline也就是注射缓冲液。第二阶段association是连续注入样品，在下面可以看到analyte和ligand结合，产生信号。第三阶段是注入缓冲液，analyte和ligand解离。第四阶段是注入再生溶液，把分析物完全洗脱掉。接着就注入缓冲液，回到基线，进入下一个分析周期。正是由于可以实现循环，因此利用SPR可以实现药物的高通量筛选。

在诸多技术中，SPR不需要做标记，而且具有时间相关性。正是由于这种时间相关性，从SPR的数据中可以得到动力学上的信息。锁和钥匙的经典模型用于描述药物-靶标的结合模式已经逐渐暴露出其不足之处。更多地，靶标是作为一种程序，而药物分子是这个程序的开关。药物分子与靶标的结合呈现变构相关。在药物设计中，我们不仅仅对配体-受体的亲和力感兴趣，还会对受体-配体形成复合物的变化感兴趣。这种变化可能涉及到溶剂化、构象变化等等。今天我们介绍一篇文献就是利用SPR技术去测量生物分子之间结合的动力学和热力学信息，并且从中得到结合模式的差别。

SH2结构域可以含有磷酸化酪氨酸的肽段结合，从而介导细胞内的信号转导过程。今天为大家介绍的这篇文献的比较了溶液中的热力学结合常数与SPR传感器中测量到的亲和力常数。发现大部分情况下溶液中的亲和力与传感器中的亲和力相同，非常大的蛋白质可能会有例外。相比于ITC，利用SPR技术测量热力学结合常熟需要的材料更少，样品浓度更低。除此之外，SPR方法获得的热力学信息也同样有用。借助SPR曲线可以对双分子模型结合的过渡态和结合模式进行分析。

作者首先测定了pYEEI肽和v-Src SH2结构与结合的热力学结合常数。分析物浓度荧光在Kd值的范围内，在SPR实验中，由于并非均相条件下的浓度，所以在A是分析物并且与Kd接近的条件下，B与复合物AB不是浓度接近，而是作为以SPR信号表征的数量接近。复合物AB的数量与SPR角度的位移成正比，而SPR角的变化在传感器图中被记录为时间的函数。

得到平衡时SPR信号以后，作为分析物浓度的函数，这些谱线与Langmuir等温线相吻合。考虑到结合在SPR传感器表面的analyte的损失，进修损耗修正可以得到亲和性数据Kc。

到这里，我们就完成了由SPR角得到热力学亲和常数Kd的过程。如果SPR技术仅仅能够完成Kd的测量，那么其相比于其它分析技术的优势可能就没有那么明显。在此条件下，如何获得其它热力学和动力学数据呢？在物理化学中我们学习了以下一些公式：

由上述四个方程我们可以推理出的范特霍夫方程如下：

在这个方程中，标有°的都是25℃下标准大气压下的常量。由此可以得到热力学常数Ka与温度、等压热容之间的函数关系。回到文献，作者测量了10~40℃下的Kd（or Ka），并且与1/T进行非线性拟合。

通过范特霍夫方程的拟合可以得到25℃下的ΔH，ΔG和TΔS的数据，以及等压热容ΔCp。将热力学参数与用等温滴定量热法 (ITC) 测定的文献值进行比较，发现25℃下的ΔH，ΔG和TΔS与ITC相比可以认为相同。而ΔCp值存在差异。作者并未给出此差异的解释。

随后，作者对pYEEI肽与γ-Src SH2结构域的结合动力学进行了分析。由于SPR信号是时间的函数，所以用于测定结合常数Kc的SPR信号也可以用于表征动力学。首先需要建立双分子相互作用的结合模型：

在该模型中，包括了两个步骤。第一步是SH2结构域（analyte）从本体溶液扩散到传感器表面的传输步骤，第二步是A和B的结合步骤。与溶液中的动力学不同，SPR中必须包含第一步运输步骤，因为SH2结构域与固定肽的结合收到质量运输限制（Mass Transport Limitation， MTL）的影响，这种影响可以简单概括为，在A和B的结合能力较强的情况下，蛋白质的扩散会成为限速步骤。根据这样的模型（MTL模型）结合SPR数据可以得到以下结果：

其中，这种模型的拟合方程为：

借助修正模型可以得到kon和koff。接下来，我们利用所得到的动力学信息对结合的过渡态进行分析（借助Eyring方程）。在Eyring的过渡态理论中，过渡态是沿着反应途径得到的高能态。如下图所示：

基于上述过程，生成过渡态AB#的过程可以被定义为

由此可以得到速率常数k：

其中kb是玻尔兹曼常数，h是普朗克常数，而K#与活化能和熵有关。与在热力学分析中建立的范特霍夫方程类似，在动力学分析的过程中可以建立Eyring方程。

由此可以获得动力学相关的活化能等参数。在本文中作者做了相关的工作，得到了Src-SH2和Grb2 SH2两种结构域与肽段结合的不同历程。

所有上述观察结果表明 Src- 和 Grb2 SH2 的结合模式存在重要差异。熵在结合过程中是差异的主要来源。

到这里，SPR的基本原理和应用已经基本结束。还有Mass Transport Limitation的产生和消除，以及Grb2 和Src SH2的结合模式的差异原因还没有解释。后续更新将会对其进行补充。