实验与培训丨本刊好文：植物色素提取实验的课外探究/陈采凤等

文章来源：陈采凤,王卫红,赵奂.植物色素提取实验的课外探究[J]. 生物学通报, 2023, 58(10): 53-55.

编者按

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本刊2023年第10期刊发的《植物色素提取实验的课外探究》一文，教师引导学生进行植物色素提取拓展实验的设计、实施和报告，更加广泛和深入地了解了植物色素，为后续植物光合作用过程和调控机制的学习奠定了基础，本期荐读。

植物色素提取实验的课外探究

陈采凤  王卫红  赵奂

（北京师范大学附属实验中学)

摘要

为了解答学生在“绿叶中色素的提取与分离”实验中产生的困惑，教师引导学生进行植物色素提取拓展实验的设计、实施和报告，更加广泛和深入地了解了植物色素，为后续植物光合作用过程和调控机制的学习奠定了基础，增加了学生的学习兴趣，锻炼了学生的生物学学科思维。

关键词

叶绿体色素 层析实验 光谱吸收

1 实验情景和思路

“绿叶中色素的提取与分离”是人教版普通高中生物学必修1《分子与细胞》第5 章第4 节“光合作用与能量转化”中的一个重要实验，也是植物生理学的经典实验。为了落实《普通高中生物学课程标准（2017 年版2020 年修订）》（以下简称《课程标准》）课程内容模块1“ 分子与细胞”中概念2.2.3“植物细胞的叶绿体从太阳光中捕获能量”，教学安排该实验为必做的教学实验。由于叶绿体中的色素是脂溶性的，实验可用无水乙醇溶解和提取绿叶中的色素，之后以石油醚∶丙酮∶苯体积比为20∶2∶1 的混合有机溶剂作为层析液，理论上可以分离出4 条清晰可见的色素条带，从下到上依次为叶绿素b、叶绿素a、叶黄素和胡萝卜素。但是在实验的过程中，有不少学生产生了疑惑，因为他们用蒸馏水研磨并提取色素，发现滤液颜色也很绿，而且后续层析结果条带也是4 条，符合预期。这是为什么？叶绿素是否溶于水？滤液为何是绿色的？滤液中的绿色是什么？

为了解答这个问题，教师引导课外兴趣小组的学生结合“细胞基本结构”章节的内容深入思考，提出假设：如果滤液中色素条带没有问题，则说明色素确实存在于滤液中，但不一定溶解在水里，可能是尚未裂解分开的叶绿体悬浮于水中。于是学生利用课外时间设计并完成了实验，用蒸馏水研磨后的滤液虽然是绿色的，但是经过离心之后，绿色物质基本全部沉淀，剩下澄清透明的棕色溶液，划线后的滤纸条带在有机层析液中层析时没有出现条带；相反，用无水乙醇提取的色素，在滤纸上划线后，在有机层析液中层析后呈现出4 条条带。黄色叶片提取的滤液在有机层析液中层析后，叶绿素和类胡萝卜素条带很窄，说明量都很少，但是叶黄素的条带很浓，说明叶黄素含量很高。同时无水乙醇提取的红色叶片色素在有机层析液层析实验中起始线位置留下明显的棕色条带，这说明这种棕色的色素不仅可以溶解在水中，也可以溶解在无水乙醇中，但不溶解在非极性更强的有机层析液中。以上实验是在教学标准实验之外的再探索，学生对植物色素的种类和性质有了更加深入的了解，更加理解了叶绿体是细胞的一个相对独立的结构，落实了《课程标准》中课程内容模块1“分子与细胞”中的概念2.2“生物化学反应发生在细胞内的特定区域”，为后续植物光合作用的原理和运用的学习奠定了基础。

2 实验内容

2.1

实验材料与仪器

1）材料：绿萝、紫藤和紫叶李的叶片，分别呈现绿色、黄色和紫红色（图1）。

2）器具与器皿：研磨器、烧杯、天平、1.5 mLEP 管、试管、滤纸条、盖玻片、载玻片、滴管、镊子、比色杯（1 cm 厚）、台灯、分光镜等。

2.2

实验试剂

无水乙醇、蒸馏水、有机层析液（石油醚∶丙酮∶二甲苯体积比为20∶2∶1）、二氧化硅、碳酸钙等。

2.3

实验步骤

2.3.1 色素提取

分别称取5 g 3 种新鲜植物叶片，剪碎，放入研钵中。加入少许二氧化硅、碳酸钙和5 mL 的无水乙醇或者蒸馏水，充分研磨，从装置上方吸取尼龙布过滤后的滤液到1.5 mL EP管中。

2.3.2 混合色素离心

将装好滤液的1.5 mL EP 离心管10 000 r/min 离心1 min，取上清液加入比色杯。

2.3.3 探究色素的光吸收特性

打开台灯电源，调解灯泡角度和分光镜的光线入口缝隙大小，通过内置的三棱镜目镜可以看到清晰的七色光谱。此时将装满滤液的比色杯挡在光线入口处，观察并记录光谱变化。

2.3.4 色素分离

1）画滤液细线。指导学生用盖玻片蘸取少量滤液，直接印在剪好尖角的滤纸条下沿1.5 cm 左右处，风干后多次重复以上操作，直到看见清晰、明显的绿色线条印迹。

2）纸层析。打开胶塞，将画好滤液细线的滤纸条尖角朝下放入试管中，保证滤液线高于层析液液面，盖紧瓶塞，静置观察。随着层析液上行，色素带缓缓上移，一段时间后保存实验结果。4组色素非常明显，从下到上，依次为浅绿色的叶绿素b、蓝绿色的叶绿素a、黄色的叶黄素及偏橙黄色的胡萝卜素。

3 实验结果与分析

3.1

无水乙醇和蒸馏水提取出的色素差异显著

校园里采摘新鲜的绿萝、紫藤和紫叶李叶片3 份，分别用无水乙醇和蒸馏水研磨并用尼龙纱布过滤获得滤液（图2，见封四），并做标记（无水乙醇组分别记为绿萝C1、紫藤C2、紫叶李C3，蒸馏水组分别记为绿萝W1、紫藤W2、紫叶李W3）。与用无水乙醇提取的紫藤叶滤液相比，用蒸馏水提取的紫藤叶片（W2）的滤液偏黄色。然而对绿萝和紫叶李的叶片而言，用无水乙醇和蒸馏水提取之后的滤液颜色没有明显差别，但仔细观察时发现，无水乙醇提取的滤液更透亮、杂质少，而蒸馏水提取的滤液相对混浊，悬浮的颗粒比较多。经过1 min 离心，用蒸馏水提取的滤液沉淀比用无水乙醇提取的沉淀多很多，滤液变澄清。这是因为用蒸馏水研磨后细胞破碎，叶绿体在滤液中悬浮，看起来整体滤液是绿色的，但透明度差。但离心后叶绿体沉淀到试管底部，滤液变澄清。用蒸馏水研磨后的绿萝上清液由原来的绿色变成了棕色（图2），这也更充分说明原来滤液中的绿色是悬浮其中的叶绿体产生，离心之后叶绿体沉淀，滤液颜色改变。而红色的紫叶李在无水乙醇提取后有棕色的色素，有别于教材里所提到的4 种色素（叶绿素a、b，胡萝卜素，叶黄素），查阅文献后得知紫叶李叶片含有20 多种花青素，侧链亲水性有差别，有些花青素可以溶解在乙醇中，有些花青素可以溶解于水中。因此，根据色素的颜色推测，实验中无水乙醇和蒸馏水提取的色素中均有可能包含一些花青素。

3.2

不同色素的吸收光谱差异显著

分光镜内置的三棱镜可以将白光中不同波长的光分离开，从目镜中可以看到清晰的七色光谱，C0 和W0 组是比色杯中分别以无水乙醇和蒸馏水为对照显示的七色光谱（图3，见封四）。之后分别将装满滤液上清液的比色杯挡在光线入口处，可见C1、C2 和C3 组中目镜光谱的蓝紫光几乎完全消失。与用蒸馏水提取的W 组相比，无水乙醇提取的色素绿光范围宽，绿光附近的波长在C1 和C2组有微小差别，可能与2 种叶片中叶绿素a、b 的含量比例差别有关。而C3 中的色素在绿光某处也有吸收，这与C1 差异明显。与C3 相比，用蒸馏水提取的色素W3 中，除了蓝紫光全部被吸收外，绿光被吸收更多，条带更窄。结合C3 组的色素滤液上清液是棕色，侧面说明C3 组中对绿光的吸收也可能是滤液中棕色的色素导致的。在蒸馏水提取的色素中，除了蓝紫光全部被吸收外，绿光被吸收更多，条带更窄。该实验清晰明了，容易观察，学生兴趣很高。

3.3

色素分离

利用无水乙醇和蒸馏水提取后的滤液划线，并分别用蒸馏水和有机层析液进行层析实验。在有机层析液层析中，绿萝（C1）中色素层析结果与教材结果一致，4 种色素条带分离明显，由下到上，依次为黄绿色的叶绿素b、蓝绿色的叶绿素a、黄色的叶黄素以及偏橙黄色的胡萝卜素。与绿萝相比，黄色紫藤叶片（C2）叶绿素a、b 的条带几乎消失，叶黄素条带明显更粗更清晰，推测大多数的叶绿素可能分解了，叶黄素含量相对较高（图4，见封四）。与绿萝相比，紫叶李（C3）中叶绿素a、b 的条带依然清晰可见，但是叶黄素条带更宽，且在滤液划线处留下明显紫红色条带。值得注意的是，无水乙醇提取的色素在蒸馏水层析中并没有分离出叶绿素a、b，叶黄素和胡萝卜素4 条带。但是与C1 相比，C2 和C3 的上方出现弥散性的黄棕色色素（图4）。而蒸馏水提取的色素经蒸馏水层析后也没有叶绿素a、b，叶黄素和胡萝卜素4 条带，但可溶性的黄棕色色素也明显地弥散性上移，W1、W3 的颜色比C1、C3要深，且整体色素宽幅大。但蒸馏水提取的色素在有机层析液中基本没有变化，说明它们不溶于非极性的层析液当中（图5，见封四）。以上结果显示，蒸馏水和无水乙醇提取的色素有本质区别，这与前面的光谱吸收相互对应。

4 实验总结与反思

《课程标准》倡导探究性学习，引导学生从表面、浅显的生物学现象入手，设计实验并寻找背后的生物学原理，从而全面提升学生的生物学学科素养。学生在课内经典实验过程中发现了问题，查阅文献并设计新的探究实验，从而解释实验中发现的困惑。适当的实验延伸和拓展充分利用了实验材料，增加了学生的学习兴趣。同时学生体验了科学探究的整个过程，通过自己设计、实施实验及分析实验结果的过程，科学思维得到了锻炼，对植物中色素及光合作用的基础知识有了更丰富的理解。

本次推送仅节选了文章部分内容，全文阅读详见本刊2023年第10期。2023年全新改版，欢迎订购！

END

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本期特邀《生物学通报》编委、北京市海淀教师进修学校教育集团周有祥老师，以一位生物学教材核心编者的视角，从课程理念出发，结合实际案例，讲解实验教学的设计与组织。

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本期排版：郭羽凡

本期责编：周津津

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