基因组编辑突变检测试剂盒(D0508S)

碧云天生产的基因组编辑突变检测试剂盒(Genome-Editing Mutation Detection Kit)，也称基因编辑突变检测试剂盒(Gene-Editing Mutation Detection Kit)，是一种简单、可靠、快速的基于T7 Endonuclease I (T7EI)的用于检测基因组DNA在基因编辑后发生突变的试剂盒。本试剂盒主要利用了T7 Endonuclease I (T7EI)能识别并酶切不完全配对的DNA双链(也称异源双链DNA，heteroduplex DNA)的特性。

本试剂盒组分特别齐全。提供了包括一步法基因组DNA提取、高保真PCR扩增、变性退火和T7EI酶切的全套试剂，并且还提供了阳性对照。

本试剂盒使用特别便捷。一步法基因组DNA提取非常快速便捷，并且提取后可以直接用于高保真PCR扩增，PCR扩增产物也可以直接用于后续的变性退火和T7EI酶切。无需额外的分离纯化步骤。

本试剂盒检测基因组编辑突变的原理如下。首先需要编辑的细胞、组织或器官通过转染、病毒感染等技术手段表达CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 nucleases)、TALEN (Transcription activator-like effector nucleases)或ZFN (Zinc-finger nucleases)等核酸酶。在细胞修复机制的介入下，这些核酸酶会在guide RNA (sgRNA)等的特异性指引下，在基因组的特异位点上产生插入或缺失突变(insertions or deletions, indels)。提取相应的基因组DNA后，通过高保真PCR扩增酶从被编辑的基因组DNA中扩增出被编辑过的DNA片段。扩增的目的片段进行变性和退火处理，然后用T7EI进行酶切鉴定。如果部分细胞中成功出现了基因编辑导致的插入或缺失突变，PCR扩增产物变性和退火后，未突变的和突变的基因之间，不同突变的基因之间，都会形成不完全配对的双链DNA。而T7EI酶能识别并酶切不完全配对的双链DNA。这样对于T7EI酶切产物进行电泳分析，就能知道基因组是否被成功编辑，以及被编辑的效率。

本试剂盒提供了一步法基因组DNA提取试剂，仅需一步孵育就可完成基因组DNA的提取。

本试剂盒包含了一组对照模板和引物预混液(Control Template & Primers)，便于用作阳性对照。对照模板包含了未突变的和突变的基因片段，未突变的基因片段PCR扩增后的长度为525bp，突变的基因片段含有7个碱基的缺失突变，PCR产物为518bp。对照模板经PCR扩增、变性和退火处理后，会形成不完全配对的双链DNA，被T7EI酶切消化后，518bp的片段会被酶切成288bp和230bp两个不同大小的片段，而完全配对的双链DNA不会被T7EI酶切消化。这样通过凝胶电泳就可以非常清晰地观察到没有被剪切的525bp和518bp的条带，和被剪切开的288bp和230bp条带。通常525bp和518bp的条带由于分子量非常接近而仅呈现一个条带。

本试剂盒提供了包含了高保真酶BeyoFusion™ DNA Polymerase的BeyoFusion™ Master Mix (2X)，确保扩增产物能被高保真扩增，不会产生基因组编辑突变检测的假阳性。

本试剂盒的PCR扩增产物可以直接用于变性退火和T7EI进行酶切。本试剂盒的PCR扩增体系和T7EI酶兼容，PCR结束后无需进行PCR产物的纯化，直接进行变性退火后就可以加入T7EI酶进行酶切鉴定分析，并且不完全匹配的双链DNA仅需15分钟就可以被充分酶切消化。

本试剂盒检测HEK293T细胞的基因组编辑突变的效果请参考图1。

图1. 碧云天生产的基因组编辑突变检测试剂盒检测HEK293T细胞基因组编辑突变的效果图。将HEK293T细胞种于六孔板中，待细胞融合度约80%的时候，用碧云天Lipo8000™转染试剂(C0533)将表达Cas9蛋白和靶向人Hace-1基因的guide RNA的质粒转染HEK293T细胞，同时转染空载质粒(empty vector)作为阴性对照。转染24h后消化细胞接种于96孔板中，每孔约3万个细胞，24h后，弃上清向孔内加入添加了Enzyme Mix的DNA Extraction Solution提取基因组(68°C, 15min; 95°C, 10min)。用BeyoFusionTM Master Mix (2X)扩增靶基因，扩增产物经变性和退火处理后(95°C 5min; 95°C-85°C, 2°C/s; 85°C-25°C, 0.1°C/s)，加入1μl T7EI，37°C酶切15min，2%琼脂糖凝胶电泳检测。转染含有靶向Hace-1基因的guide RNA的质粒时会形成插入或缺失突变，进行基因扩增后，未突变的和突变的基因片段配对会形成不完全匹配的双链DNA，被T7EI识别和酶切后，约520bp的退火片段中的不完全匹配的双链DNA会被酶切成约290bp和230bp的两个片段。转染空载质粒对靶基因没有影响，不会产生T7EI酶切产生的小片段。

-20℃保存，至少一年有效。Enzyme Mix和BeyoFusion™ Master Mix (2X)尽量避免多次反复冻融。

配制细胞裂解液时，DNA Extraction Solution和Enzyme Mix混匀后，应尽快使用，放置太久可能会影响DNA抽提效果。

对于首次使用本试剂盒的情况，强烈推荐使用本试剂盒提供的Control Templates & Primers作为阳性对照。其PCR产物经变性退火后，可以作为T7 Endonuclease I酶消化的阳性对照。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。