一种双频受激拉曼散射显微成像系统

1.本发明涉及非线性光学显微成像领域，尤其涉及一种双频受激拉曼散射显微成像。

背景技术：

2.受激拉曼散射显微镜是一种基于分子振动的非线性光学成像技术，主要利用两束激光之间的差频与拉曼活性分子振动形成共振，从而获得静态和动态生命系统中的分子化学特征图，实现高灵敏度、高精度和高特异性的分析。这种非侵入成像方式能直接可视化复杂的生物过程，从而被广泛应用于生物医学领域，例如评估外周神经退化，识别新鲜、未加工组织的肿瘤边缘，以及发现侵袭性癌症的生物标志物和治疗靶点。3.基于光谱聚焦的受激拉曼散射显微成像可高效利用飞秒脉冲能量，并可同时兼容其他非线性光学成像系统。然而，光谱聚焦受激拉曼散射显微成像通常以逐帧方式实现光谱扫描，在无标记(不使用拉曼探针)的生物样品上通常需要几分钟才能采集完整光谱。其他受激拉曼散射光谱成像方案，如波长可调谐窄带激光器、脉冲整形、傅里叶域或压缩域的光谱编码、并行探测，往往需要更高参数要求的光学设备或者空间占用较多且不易操作的复杂光路结构，且在速度和信噪比方面，尚未能满足生命科学领域对于研究动态生物过程和快速高质量成像的需求。4.双频受激拉曼散射显微成像系统能够同时获取两种分子(脂质、蛋白质)的成像，作为无标记组织学工具，具有识别肿瘤组织的潜力，能获得类似于苏木精和伊红(h;e)染色法的诊断结果，且能够对新鲜的、未染色的组织进行即时成像而无需繁琐的染色步骤。

技术实现要素：

5.本发明的主要目的在于提供一种双频受激拉曼散射显微成像系统，旨在实现一种实时、高信噪比和高空间分辨率的低成本、高兼容的双频受激拉曼显微成像技术，解决了光谱聚焦受激拉曼显微成像系统获取信息耗时较长的问题。6.为实现上述目的，本发明提供一种双频受激拉曼散射显微成像系统，包括信号产生与调制装置及成像处理终端，信号产生与调制装置包括：脉冲啁啾与延迟模块，用于使两束光的光谱分量在时间上有一定的分布且时间上重叠；双相调制模块，用于对两路激发光进行高频强度调制；双差频模块，用于使两束激发光的水平偏振和垂直偏振满足两类分子的拉曼频移；扫描与聚焦模块，用于将激发光聚焦至样品并实现点扫描；成像处理终端包括：正交解调模块，用于对经样品的探测信号进行同步正交解调；信号采集与同步控制模块，用于实现扫描系统驱动与解调结果采集的同步控制。7.其中，系统还包括：飞秒激光器、第一半波片、第一偏振分束器、第二半波片、第二偏振分束器；飞秒激光器用于同步输出两路飞秒脉冲，第一束激光经第一半波片以改变激光的线偏振角度，输出光经第一偏振分束器，输出水平偏振态光束，结合第一半波片可调节该光束的激光功率；第二束激光经过第二半波片以改变激光的线偏振角度，输出光经第二偏振分束器，结合第二半波片可调节第二束光的激光功率，两束激发光再同时入射至脉冲啁啾与延迟模块。8.其中，所述脉冲啁啾与延迟模块包括：第一玻璃棒，用于将所述第一偏振分束器分出的另一束激光啁啾展宽为皮秒光束；第二玻璃棒，用于将穿过所述第二偏振分束器的一束激光啁啾展宽为皮秒光束；第一时间延迟单元，用于调节第一束激光光路的光程，使两光束经脉冲啁啾后可实现时间重叠；所述第一束光经过第一玻璃棒，再经过第一时间延迟单元；所述第二束光经过第二玻璃棒，入射至双相调制模块。9.其中，所述双相调制模块包括：第三半波片，用于改变激光束的线偏振角度；第一四分之一波片，用于改变激发光束的偏振态；电光调制器，用于对激发光束进行强度调制；10.其中，经过第二玻璃棒的光束经第三半波片后为偏振角度为45°的线偏振光，再经过所述第一四分之一波片为圆偏振光，输出光由所述电光调制器进行强度调制，该光束与经过所述第一时间延迟单元的光束由第一二向色镜进行波长耦合，再经第一4f系统后入射至双频差模块。11.其中，所述双频差模块包括：第三偏振分束器，用于光束的偏振分离与偏振合束；第一中空屋脊棱镜反射镜，用于设置光学延迟线；第二中空屋脊棱镜反射镜，用于设置光学延迟线；经所述第一4f系统的激光光束入射至第三偏振分束器，分离为水平偏振态和垂直偏振态，水平偏振态入射至扫描与聚焦模块，垂直偏振态依次经第一、第二中空屋脊棱镜反射镜后与水平偏振态由第三偏振分束器耦合，入射至扫描与聚焦模块。12.其中，采用所述第一中空屋脊棱镜反射镜、第二中空屋脊棱镜反射镜设置的光学延迟线，可使经第三偏振分束器分离的水平偏振和垂直偏振光路的光程差能够匹配组织中两种分子所对应的拉曼频差。13.其中，所述扫描与聚焦模块包括：xy扫描振镜，用于实现样品的xy方向的二维扫描；远心扫描透镜与套筒透镜，用于在样品平面产生整个视场内恒定的光斑尺寸，同时可有效矫正像差；显微物镜，用于激发光束聚焦；经过双频差模块的激光束依次经过xy扫描振镜、远心扫描透镜与套筒透镜及显微物镜，实现样品的二维扫描激发，信号光由正交解调模块探测与分析。14.其中，所述正交解调模块包括：聚光镜，用于透射信号光的收集；聚焦透镜，用于信号光束的聚焦；滤光片，用于滤除掉探测光束外的其他光束；第四偏振分束器，用于将信号光分离为垂直偏振态和水平偏振态；双通道光电探测器，用于分别将水平偏振态信号光和垂直偏振态信号光转化为第一、第二电压信号；移相器，用于将第一电压信号进行π/2相移；加法器，用于将所述移相器输出的第一电压信号与所述双通道光电探测器输出的第二电压信号进行线性叠加；锁相放大器，用于实现水平偏振态信号光和垂直偏振态信号光的正交解调；15.其中，经过所述样品后的前向散射信号，经由所述聚光镜收集，并通过所述聚焦透镜进行光束聚焦，聚焦后的光束经所述第四偏振分束器分离为水平偏振态信号光和垂直偏振态信号光，采用所述双通道光电探测器对两个偏振态信号光束进行探测，将两个偏振态光束转换为第一、第二电压信号，采用所述移相器对第一电压信号进行π/2相移，并通过所述加法器将其与第二电压信号进行线性叠加，并连接至锁相放大器进行正交解调。16.其中，所述双相调制模块与正交解调模块还包括：信号发生器；所述信号发生器，用于同时输出两路参数相同的模拟信号；一路用于驱动所述电光调制器，另一路用于所述锁相放大器的参考信号；所述锁相放大器的信号输入端信号为水平偏振态信号与垂直偏振态信号的线性叠加，锁相放大器的解调选择xy正交输出，分别对应于两个偏振态所对应的拉曼频移信号。17.其中，所述信号采集与控制系统包括：多功能采集卡与控制器；所述多功能采集卡用于驱动所述扫描与聚焦模块中的扫描振镜与所述正交解调模块中两路正交输出的电压信号的采集，并实现上述信号输出与采集的同步控制；所述控制器，用于控制脉冲啁啾与延迟模块中的第一延迟单元，载物台运动控制及所述扫描与聚焦模块中物镜的运动控制。18.其中，所述脉冲啁啾与延迟模块中的第一玻璃棒和第二玻璃棒均为色散装置。所述色散装置还可以为光栅对、棱镜对以及光纤或其他的线性啁啾装置。。19.本发明提供一种双频受激拉曼散射显微成像系统，有益效果在于：能够利用双相调制模块，对两路不同偏振态的激发光束同时进行高频强度调制，而后通过偏振分束器进行偏振分离，并结合双差频模块，以使两束激发光的水平偏振和垂直偏振满足两类分子的拉曼频移；双频受激拉曼信号可由正交解调模块进行同时解调，最终实现一种实时、高信噪比和高空间分辨率的低成本、高兼容的双频受激拉曼显微成像系统。附图说明20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。21.图1为本技术实施例多模态非线性显微成像系统的结构示意框图；22.图2为本技术实施例多模态非线性显微成像系统的结构示意图。具体实施方式23.为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。24.请参阅图1，为一种双频受激拉曼显微成像系统，包括：信号产生与调制装置及处理终端，信号产生与调制装置用于信号生成与信号调制，处理终端用于受激拉曼信号的解调与图像重构。25.信号产生与调制装置包括：脉冲啁啾与延迟模块101、双相调制模块102、双频差模块103和扫描与聚焦模块104；脉冲啁啾与延迟模块101，用于使两束光的光谱分量在时间上有一定的分布且时间上重叠；双相调制模块102，用于对两路激发光进行高频强度调制；双差频模块103，用于使两束激发光的水平偏振和垂直偏振满足两类分子的拉曼频移；扫描与聚焦模块104，用于将激发光聚焦至样品并实现点扫描；成像处理终端包括：正交解调模块105和信号采集与同步控制模块106；正交解调模块105，用于对经样品的探测信号进行同步正交解调；信号采集与同步控制模块106，用于实现扫描系统驱动与解调结果采集的同步控制。26.在本实施例中，正交解调模块105的参考信号与双相调制模块102的驱动信号为同一信号；信号采集与同步控制模块106与正交解调模块105和扫描与聚焦模块104均为电信号连接与传输；根据信号采集与同步控制模块106的逻辑同步，对正交解调模块105输出的双频受激拉曼信号进行图像重构。27.本实施例提供的双频受激拉曼显微成像系统，能够利用双相调制模块102，对两路不同偏振态的激发光束同时进行高频强度调制，而后通过偏振分束器进行偏振分离，并结合双差频模块103，以使两束激发光的水平偏振和垂直偏振满足两类分子的拉曼频移；双频受激拉曼信号可由正交解调模块105进行同时解调，最终实现一种实时、高信噪比和高空间分辨率的低成本、高兼容的双频受激拉曼显微成像系统。28.请参阅图2，在一个实施例中，系统还包括：飞秒激光器1、第一半波片2、第一偏振分束器3、第二半波片4、第二偏振分束器5；飞秒激光器1用于同步输出两路飞秒脉冲，第一束激光经第一半波片2以改变激光的线偏振角度，输出光经第一偏振分束器3，输出水平偏振态光束，结合第一半波片2可调节该光束的激光功率；第二束激光经过第二半波片4以改变激光的线偏振角度，输出光经第二偏振分束器5，结合第二半波片4可调节第二束光的激光功率，两束激发光再同时入射至脉冲啁啾与延迟模块101；29.在一个实施例中，脉冲啁啾与延迟模块101包括：第一玻璃棒6、第二玻璃棒7、第一时间延迟单元8。其中，第一玻璃棒6，用于将所述第一偏振分束器分出的另一束激光啁啾展宽为皮秒光束；第二玻璃棒7，用于将穿过所述第二偏振分束器的一束激光啁啾展宽为皮秒光束；第一时间延迟单元8，用于调节第一束激光光路的光程，使两光束经脉冲啁啾后可实现时间重叠；所述第一束光经过第一玻璃棒6，再经过第一时间延迟单元8；所述第二束光经过第二玻璃棒7，入射至双相调制模块102；30.在本实施例中，脉冲啁啾与延迟模块101可对飞秒激光器1输出的宽带飞秒光束引入线性啁啾，并通过调整相应的色散补偿装置的参数满足第一束光(泵浦光)和第二束光(斯托克斯光)具有相同的线性啁啾参数，在该过程中两束光的瞬时频率差恒为常数，其差频频谱带宽远窄于两者的傅里叶变换极限频谱的差频带宽，可以实现高光谱分辨的受激拉曼散射显微成像。31.在本实施例中，第一玻璃棒6、第二玻璃棒7均为色散装置；在其他实施例中，色散装置还可以为光栅对、棱镜对以及光纤或其他的线性啁啾装置等来代替本实施例中的第一玻璃棒6和第二玻璃棒7。32.在一个实施例中，双相调制模块102包括：第三半波片9、第一四分之一波片10、电光调制器11；其中，第三半波片9，用于改变激光束的线偏振角度；第一四分之一波片10，用于改变激发光束的偏振态；电光调制器11，用于对激发光束进行强度调制；经过第二玻璃棒7的光束经第三半波片9后为偏振角度为45°的线偏振光，再经过所述第一四分之一波片10为圆偏振光，输出光由所述电光调制器11进行强度调制，该光束与经过第一时间延迟单元8的光束由第一二向色镜12进行波长耦合，再经第一4f系统13后入射至双频差模块103；33.在本实施例中，第二束光(斯托克斯光)由20mhz的谐振电光调制器11进行强度调制。为了在较低的驱动电压下提高调制深度，使用第三半波片9和第一四分之一波片10令斯托克斯光由线偏振态转为圆偏振态。若输入电光调制器11为线偏振光，则驱动电压信号必须从0v变化至vπ(或者从-vπ至0v)以实现入射光振幅的完全调制。当输入电光调制器的是圆偏振光，完全调制入射光振幅只需要-1/2vπ到1/2vπ的驱动电压。34.在一个实施例中，双频差模块103包括：第三偏振分束器14、第一中空屋脊棱镜反射镜和第二中空屋脊棱镜反射镜15；其中，第三偏振分束器14，用于光束的偏振分离与偏振合束；第一中空屋脊棱镜反射镜和第二中空屋脊棱镜反射镜15，用于设置光学延迟线；经第一4f系统13的激光光束入射至第三偏振分束器14，分离为水平偏振态和垂直偏振态，水平偏振态入射至扫描与聚焦模块，垂直偏振态依次经第一中空屋脊棱镜反射镜14、第二中空屋脊棱镜反射镜15后与水平偏振态由第三偏振分束器耦合，入射至扫描与聚焦模块104；35.在本实施例中，第三偏振分束器14用于双相调制模块103的检偏，且将合束光分为水平偏振和垂直偏振两路激发光。其中，水平偏振的斯托克斯光的强度变化为sin(ωt+α)，垂直偏振的斯托克斯光的强度变化为-sin(ωt+α)，ω＝2πf，f为调制频率，α为初始相位。分束后的两路泵浦光的偏振态与其同路共线的斯托克斯光的偏振态保持一致，因此无需考虑拉曼退偏比的影响。36.在本实施例中，采用第一、第二中空屋脊棱镜反射镜15设置的光学延迟线，可使经第三偏振分束器分离的水平偏振和垂直偏振光路的光程差能够匹配组织中两种分子所对应的拉曼频差；在该过程中，垂直偏振的激发光经同一偏振分束镜再次合束。37.在一个实施例中，扫描与聚焦模块104包括：xy扫描振镜16、远心扫描透镜17与套筒透镜18，以及显微物镜19；其中，xy扫描振镜16，用于实现样品的xy方向的二维扫描；远心扫描透镜17与套筒透镜18，用于在样品平面产生整个视场内恒定的光斑尺寸，同时可有效矫正像差；显微物镜19，用于激发光束聚焦。经过双频差模块103的激光束依次经过xy扫描振镜16、远心扫描透镜17与套筒透镜18及显微物镜19，实现样品20的二维扫描激发，信号光由正交解调模块105探测与分析。38.在一个实施例中，正交解调模块105包括：聚光镜21、聚焦透镜22、滤光片23、第四偏振分束器24、双通道光电探测器25、移相器26、加法器27以及锁相放大器28；其中，聚光镜21，用于透射信号光的收集；聚焦透镜22，用于信号光束的聚焦；滤光片23，用于滤除掉探测光束外的其他光束；第四偏振分束器24，用于将信号光分离为垂直偏振态和水平偏振态；双通道光电探测器25，用于分别将水平偏振态信号光和垂直偏振态信号光转化为第一、第二电压信号；移相器26，用于将第一电压信号进行π/2相移；加法器27，用于将所述移相器输出的第一电压信号与所述双通道光电探测器输出的第二电压信号进行线性叠加；锁相放大器28，用于实现水平偏振态信号光和垂直偏振态信号光的正交解调；39.在本实施例中，经过样品20后的前向散射信号，经由所述聚光镜21收集，并通过所述聚焦透镜22进行光束聚焦，聚焦后的光束经所述滤光片23后由所述第四偏振分束器24分离为水平偏振态信号光和垂直偏振态信号光，采用所述双通道光电探测器25对两个偏振态信号光束进行探测，将两个偏振态光束转换为第一、第二电压信号，采用所述移相器26对第一电压信号进行π/2相移，并通过所述加法器27将其与第二电压信号进行线性叠加，并连接至锁相放大器28进行正交解调；40.在本实施例中，第二激发光束(斯托克斯光)经样品20的散射信号被光密度(od)大于6的带通滤光片23滤除，泵浦光经第四偏振分束器24分离后由双通道移相探测器25检测。探测器具有两个感光面积为1×1cm2的光电二极管，通过直流电源对其施加-24v的反向偏置电压以提高其探测灵敏度。二极管的光电流信号经带宽为100mhz跨阻放大器转换为电压信号。采用移相器26对第一电压信号增加π/2相位，使其调制强度变为-sin(ωt+α+π/2)，即-cos(ωt+α)，经加法器27与第二电压信号进行线性叠加后输入锁相放大器28，由此解调出两路受激拉曼损耗(srl)信号。此时两路srl解调信号正交，可分别作为解调振幅的xy分量输出。41.在本实施例中，正交双相的两路srl信号可表示为[0042][0043]通过设置合适的参考信号相位β，两路srl信号可通过同相(x)和正交(y)解调，从而得到两路分子振动信号i(ω1)和i(ω2)。相比于定制双通道解调的锁相放大器，设计、印刷和焊接这种探测器价格便宜，且易于部署在任何光谱聚焦受激拉曼散射成像系统。[0044]在一个实施例中，双相调制模块102与正交解调模块105还包括：信号发生器29，用于同时输出两路参数相同的模拟信号；一路用于驱动所述电光调制器，另一路用于所述锁相放大器的参考信号；[0045]在一个实施例中，信号采集与控制系统106包括：多功能采集卡与控制器30；其中，多功能采集卡用于驱动所述扫描与聚焦模块中的扫描振镜与所述正交解调模块中两路正交输出的电压信号的采集，并实现上述信号输出与采集的同步控制；控制器，用于控制脉冲啁啾与延迟模块中的第一延迟单元，载物台运动控制及所述扫描与聚焦模块中物镜的运动控制；[0046]在本技术的所有实施例中，为了便于激光的传输，均能够使用反射镜来改变激光的方向。[0047]在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其它实施例的相关描述。[0048]以上为对本发明所提供的一种双频受激拉曼散射显微成像系统的描述，对于本领域的技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。