全网最详细同源重组法构建重组表达载体的步骤（细节满满）

Gibson克隆是一种DNA无缝克隆技术，可将插入片段定向克隆到载体的任意位点。将载体进行线性化，在插入片段正/反向PCR引物5'端引入线性化载体的末端序列，使得PCR产物5'和3'最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列(15 - 20 bp)。这种PCR产物和线性化载体按一定比例混合后，在重组酶的催化下在一定的温度反应一定的时间即可完成定向克隆。

A. 载体线性化 B. PCR获得带有同源臂的插入片段 C. 重组反应 D. 转化感受态

实验流程：

线性化载体制备

（1）选择合适的克隆位点，对载体进行线性化。尽量选择无重复序列且载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量在40% - 60%之间的位点进行克隆。

（2）选择合适的载体线性化方式：限制性内切酶消化或反向PCR扩增

（2.1）酶切制备线性化载体时，推荐使用双酶切方法使载体线性化完全，降低转化背景(假阳性克隆)；若使用单酶切线性化，可以适当延长酶切时间以减少环状质粒残留，降低转化背景（如酶的说明书是切30min，那么可适当延长至60min）（以Thermo-Fast Digest NotI酶为例）。

（2.2）反向PCR扩增制备线性化载体时，推荐使用高保真聚合酶进行扩增，减少扩增突变的引入。50 μl的PCR体系中，推荐使用0.1 - 1 ng环状质粒模板，或使用预线性化质粒作为模板，以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。

1. 选择已知序列中没有而两侧都存在的限制性内切酶位点切割；

2. 将酶切片段在连接酶作用下环化，使已知序列位于环状分子上；

3. 根据已知序列的两端设计两个引物，以环状分子为模板进行PCR，扩增出已知序列两侧的未知序列。

2.插入片段获得

（1）引物设计：在插入片段正反向扩增引物的5’端引入线性化载体两末端同源序列，使扩增后的插入片段5'和3'最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应一致的同源序列(15 - 20 bp，不包括酶切位点)。

引物设计原则：同源臂(15 - 20 bp，不计算酶切位点和残留碱基，GC含量40% - 60%)+ 酶切位点(根据实验需求保留或者舍弃) + 特异性引物(引物Tm值的计算不包括同源臂的序列)。

插入片段正向扩增引物设计方式为：

5'--上游载体末端同源序列 + 酶切位点(可保留或删除) + 基因特异性正向扩增引物序列--3'

插入片段反向扩增引物设计方式为：5'--下游载体末端同源序列 + 酶切位点(可保留或删除) + 基因特异性反向扩增引物序列--3'

（上/下游载体末端同源序列即线性化载体最末端序列(用于同源重组)，GC含量40% - 60%）

（基因特异性正/反向扩增引物序列即常规插入片段正/反向扩增引物序列，Tm值60 ~ 65℃）

1. 根据自身需要保留或删除酶切位点 2. 计算退火温度时，只计算基因特异性扩增序列的Tm值，引入的同源序列和酶切位点不参与计算 3.引物长度超过40bp时，在引物合成时可以选用PAGE纯化方式，提高阳性克隆率 4.插入片段有多个重复序列时，可以根据自身实验需要添加一部分碱基设计引物）

（2）插入片段PCR扩增

使用高保真聚合酶扩增，无需考虑产物末端有无A尾(重组过程中将被去除，在最终载体中不会出现)。为了确保最优条件，可以先设置梯度PCR确定最佳退火温度。按照高保真聚合酶的特性配置PCR体系，根据扩增片段的大小设置合适的延伸时间，确定最佳的PCR条件（以Thermo高保真聚合酶为例）。

配置PCR体系

根据扩增产物的片段大小确定extension时间，确定PCR条件。

 3. 胶回收纯化线性化载体与插入片段

根据载体和插入片段的大小确定相应浓度的胶进行胶回收，不同的插入片段要更换新的刀片，防止外源DNA的污染。胶回收完成后琼脂糖凝胶电泳验证回收产物，Qubit测定插入片段和线性化载体的浓度以定量。

4. 线性化载体与插入片段的使用量计算

以Vazyme重组反应体系为例，20 ul重组反应体系中最适克隆载体使用量为0.03 pmol，最适插入片段使用量为0.06 pmol(载体与插入片段摩尔比为1:2)。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：

最适克隆载体使用量 = [0.02 × 克隆载体碱基对数] ng（0.03 pmol）

最适插入片段使用量 = [0.04 × 插入片段碱基对数] ng（0.06 pmol）

例如，将长度为2 kb的插入片段克隆至长度为5 kb的克隆载体时，克隆载体的最适使用量应为：0.02 × 5,000 = 100 ng；插入片段最适使用量应为：0.04 × 2,000 = 80 ng。

注意：1. 当插入片段长度大于克隆载体时，最适克隆载体与插入片段使用量的计算方式应互换，即将插入片段当做克隆载体，克隆载体当做插入片段进行计算。

2. 20 ul重组体系中线性化克隆载体的使用量应在50 - 200 ng之间；插入片段扩增产物的使用量应在10 - 200 ng之间。当使用上述公式计算DNA最适使用量超出这个范围时，直接选择最低/最高使用量即可。

3. 线性化克隆载体和插入片段扩增产物未进行DNA纯化直接使用时，加入总体积应不超过反应体系体积的1/5，即4 ul。

5. 重组反应（Vazyme为例）

（1）计算重组反应所需的线性化载体和插入片段所需DNA量

（2）稀释线性化载体和重组片段，确保各组分加入量不低于1ul

（3）冰上配置反应体系：

1. 可以根据自身需要配置10ul体系; 2. X/Y根据公式计算得到载体用量和插入片段用量;

（4）移液器轻轻吸打混匀(请勿振荡混匀)，短暂离心将反应液收集至管底。

（5）PCR仪器37℃反应30 min；降至4℃或立即置于冰上冷却。重组产物可于-20℃存放一周，待需要时解冻转化即可。

6. 重组产物转化

（1）冰上解冻克隆感受态细胞(如：DH5α Competent cell）

（2）取10 μl重组产物加入到100 μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30 min。

▲重组产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的1/10（100ul感受态转化的菌落可能又小又密，菌落PCR以及后续操作完成比较困难，可以根据需要减少感受态用量至20-50ul）

（3）42℃水浴热激45 sec后，立即置于冰上冷却3 min。

（4）加入500 μl SOC或LB培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1 h(转速200 - 250 rpm)。

（5）LB固体培养基涂布相应抗性，在37℃培养箱中预热。

（5）7,000 rpm离心3 min，弃掉500 μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀（可以根据自己想要的结果将重悬的菌液分开几份涂布到相应的抗性板上）。

（6）37℃培养箱中倒置培养12 - 16 h。

7. 重组反应产物鉴定

（1）挑取LB板上的单克隆若干个进行菌落PCR鉴定，菌落较小时，用牙签先在PCR体系中涮几下，再到装有LB的离心管里面涮几下。菌落较大时可以直接挑一半到PCR体系中，留一半做LB摇菌。做菌落PCR的单克隆要和之后LB摇菌的单克隆保持一致，注意做好标记。

（2）扩增引物尽量选择载体骨架上的引物，根据自己所扩增产物的大小和使用的酶确定延伸时间和PCR程序。琼脂糖凝胶电泳检测克隆正确时应有长度略大于插入片段大小的条带出现。

（3）菌落PCR鉴定为阳性的菌落，接种至含有适当抗生素的液体LB培养基中培养过夜。

8. 提取质粒

提取质粒进行酶切鉴定，或直接进行一代测序。

原核表达载体的构建→转化到高效表达的宿主菌→目的蛋白的诱导表达→细菌的扩大培养→制备细菌蛋白粗提物→目的蛋白质的纯化。