单细胞空间组学助力打开胚胎早期发育的“黑匣子”

时空简讯第46期。

现代胚胎发育生物学的研究多集中在模式动物小鼠、斑马鱼等，而基于伦理的考虑，人类胚胎发生的早期窗口期在很大程度上是未知的。随着新兴单细胞和空间组学技术、体外胚胎培养技术等的发展，让我们看到了打开人类胚胎早期发育“黑匣子”的希望。在此，本期遴选了10篇有关应用单细胞和空间组学技术研究胚胎早期发育和各器官形成的文章，以期为理解正常的器官发生、突变、环境和传染性疾病对人类发育的影响提供参考。

全胚胎

Whole Embryo

人类所有转录因子异构亚型的条形码文库和转录因子图谱

Cell [IF：66.850]

① 创建了一个包含所有注释的人类转录因子（transcription factors，TF）剪接异构体（3548）的条形码ORF（开放阅读框）库，并将其应用于构建超过110万个细胞的TF图谱，以单细胞分辨率绘制每个TF过表达在人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）中引起的表达谱变化。

② IF图谱将IF诱导的表达谱映射到参考细胞类型，能够系统地识别驱动细胞状态变化的TFs，包括从所有三个胚层和滋养层产生细胞类型，以及broad-spectrum发现，如orphan TFs的分类。

③ 利用文库进行靶向和顺序的TF筛选，创建了一个定制的细胞疾病模型，并整合mRNA表达和染色质可及性数据，表征了IF调控网络。

④ 通过开发和验证一种预测TF组合的策略来表征组合TF过表达的影响，该策略可以产生匹配参考细胞类型的目标表达谱，以推动细胞工程的发展。（Lina）

条形码文库和转录因子图谱的构建流程

A transcription factor atlas of directed differentiation.

2023.01.05；DOI：10.1016/j.cell.2022.11.026

研究文章；人，胚胎，转录因子，胚胎干细胞，基因表达；Julia Joung, Sai Ma, Tristan Tay, Kathryn R. Geiger-Schuller, Feng Zhang; MIT, Broad Institute of MIT and Harvard, McGovern Institute for Brain Research at MIT, Harvard University; USA.

VASA-seq：单细胞高通量总RNA测序新技术

Nature Biotechnology [IF：68.164]

① 开发了单细胞全长总转录组测序新技术——VASA-seq，同时检测多聚腺苷化和非多聚腺苷化转录本，测序数据可用于选择性剪接（native splicing，AS）分析；该技术在基于平板和液滴微流控的流程中兼容，具有唯一片段标识符（unique fragment identifier，UFI），且基因组覆盖率检测均匀、敏感度较高、成本较低、节约时间。

② 将VASA-seq分析33,662个小鼠胚胎（E6.5、E7.5、E8.5和E9.5）的单细胞，发现了许多长非编码RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）细胞类型标记；通过比较VASA-seq与10x平台数据集，发现前者检测到较低比例蛋白质编码转录本，而lncRNAs和转录因子的检测水平约高出2~3倍，不过sncRNAs仅在VASA-seq数据集中被捕获。

③ VASA-seq可检测到大量组蛋白编码转录本作为周期细胞标记物，用于细胞周期和细胞类型组蛋白基因表达差异分析，发现一些组蛋白基因表现出生殖层或细胞类型特异性表达；使用VASA-seq可进行更灵敏的RNA速度评估，在细胞图谱中实现更准确的发育轨迹预测，揭示血液成熟过程的不同轨迹。

④ 使用VASA-seq全长覆盖率跨细胞类型识别小鼠发育过程中AS模式，如心脏形态、早期原肠胚、胚胎外组织和血液的发育等；通过红细胞差异剪接分析，发现了广泛的跨膜细胞骨架蛋白重排。（Yuki）

VASA-seq单细胞分子工作流程示意图

High-throughput total RNA sequencing in single cells using VASA-seq.

2022.06.27；DOI：10.1038/s41587-022-01361-8

研究文章；小鼠，胚胎，心脏、血液，VASA-seq，选择性剪接，非多聚腺苷化转录本，非编码转录本，组蛋白基因，细胞周期；Fredrik Salmen, Joachim De Jonghe, Florian Hollfelder, Alexander van Oudenaarden; Hubrecht Institute-KNAW (Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences) and University Medical Center, Oncode Institute, University of Cambridger; Netherlands, UK.

空间分辨单细胞转录组图谱阐明人类胚胎的早期器官发生

Nature Cell Biology [IF：28.213]

① 联合scRNA-seq和空间转录组技术，构建了人类胚胎在器官发育初期（4～6周）详细的空间分辨单细胞转录组图谱（HEOA：https://heoa.shinyapps.io/base/），深度刻画了各个器官最初的特异性祖先状态，并发现未知细胞类型和人特异性空间模式，以及脊椎动物中保守的阶段调控机制。

② 基于185,140个单细胞转录组，生成了18个发育系统中313个簇的综合图集，并结合157篇文献中总结的细胞类型信息，实现了对人类早期器官发生的细胞类型的深度注释。

③ 结合胚胎切片上的空间转录组，描述了头部中胚层中以前未被重视的细胞类型，以及与邻近组织的潜在相互作用。

④ 结合其他脊椎动物的数据，揭示了轴（axis）的空间模式、发育进程的系统时间调控和潜在的人类特异性调控。（Lina）

早期人类胚胎的单细胞转录组图谱

A single-cell transcriptome atlas profiles early organogenesis in human embryos.

2023.03.16；DOI：10.1038/s41556-023-01108-w

研究文章；人，胚胎，器官发生，细胞类型，发育，scRNA-seq，空间转录组；Yichi Xu, Tengjiao Zhang, Zhirong Bao, Weiyang Shi; Sloan Kettering Institute, 上海市东方医院(同济大学附属东方医院)再生医学研究所, 中国海洋大学；USA，中国

利用单细胞和空间转录组了解在早期胚胎发育过程中的干细胞谱系规范

Annual Review of Genomics and Human Genetics [IF: 7.243]

① 胚胎发育和干细胞分化为理解协调细胞命运决定的分子调控和组织模式的构建提供了范例；scRNA-seq和空间转录组等新兴技术为剖析细胞组织、形态和分子特性的分化，以及血统分配开辟了新途径。

② 描述了scRNA-seq分析在干细胞系的分子轨迹和基因调控网络研究中的应用，如预测细胞谱系分析轨迹、解析谱系变化和分子特征、推断基因调控网络。

③ 强调了单细胞和空间转录组的综合实验和计算分析在描述早期发育过程中细胞谱系的起源和轨迹的重要意义。

④ 单细胞、空间转录组分析结合单细胞成像追踪和对发育中的胚胎中单个细胞位置的了解，可确定每种细胞类型的谱系；比较非人类灵长类和小鼠的原肠期研究，以及体内体外实验模型的相关性，揭示原肠期发育过程中的分子结构和谱系特征将成为胚胎发育研究中的一个极其重要的课题。（马扬）

利用单细胞和空间转录组的方法绘制细胞谱系

Using single-cell and spatial transcriptomes to understand stem cell lineage specification during early embryo development.

2020.04.27；DOI：10.1146/annurev-genom-120219-083220

综述；胚胎发育，细胞谱系，干细胞分化，轨迹推断，单细胞转录组学，空间转录组；Guangdun Peng, Naihe Jing; 中国科学院广州生物医药与健康研究院，北京干细胞与再生医学研究院，中国科学院大学；中国

胚胎脑

Fetal Brain

scRNA-seq和ATAC-seq联合绘制人类大脑海马体的细胞图谱和基因调控网络

Nature [IF：42.778]

① 通过scRNA-seq和ATAC-seq联合分析，阐明了人海马体胚胎发育过程中的基因表达调控网络和细胞命运决定因子，绘制了高精度发育细胞图谱，解析了海马发育过程中的不同细胞类型及其关键的分子与调控网络。

② 使用scRNA-seq分析16~27孕周人胚胎海马体的30,416个细胞，确定了47种不同的细胞亚型及其发育轨迹，并鉴定了PAX6+和HOPX+海马祖细胞的迁移路径和细胞谱系，以及CA1、CA3和齿状回神经元的区域标记物。

③ PROX1转录起始位点附近存在LEF1或TCF4的三个潜在结合位点，揭示了齿状回神经元标志物PROX1的转录调控网络；海马体的兴奋性神经元在16孕周进行突触组织和轴突的发生，且海马体的非齿状回区域的兴奋性神经元比前额叶皮质更成熟，阐明了发育中人类前额叶皮质和海马的空间特异性基因表达。

④ 16~27孕周的人海马体分子特征与出生0~5 d的小鼠相似，但人海马体存在灵长类特有的基因，如NBPF1，揭示了这两物种在时空上基因表达的不同。

⑤LHX2在NBPF1-GFP+细胞中高表达，且在PROX1起始位点附近发现LHX2的3个潜在的结合位点，表明NBPF1可能通过LHX2调节海马的发育；灵长类动物特异性基因NBPF1的瞬时表达会导致小鼠海马中的PROX1+细胞的显著增加。（杰）

海马体细胞的t-SNE图谱

Decoding the development of the human hippocampus.

2020.01.15；DOI：10.1038/s41586-019-1917-5

研究文章；人，小鼠，胚胎，海马体，发育，跨物种比较，基因调控网络，scRNA-seq，ATAC-seq；Suijuan Zhong, Wenyu Ding, Le Sun, Yufeng Lu, Qian Wu, Xiaoqun Wang；中国科学院生物物理研究所，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心，北京师范大学，中国科学院大学；中国

scRNA-seq揭示大脑皮层神经元时空发育过程

Science Advances [IF: 13.116]

① 收集妊娠早期到中期（9~28周）的人类胚胎脑组织样本，应用scRNA-seq获得14,239个单细胞数据，全面绘制了胚胎发育关键阶段的大脑皮层额叶（frontal lobe，FL）、顶叶（parietal lobe，PL）、枕叶（occipital lobe，OL）、颞叶（temporal lobe，TL）以及皮层下区域脑干（pons）的转录组图谱，鉴定了8种主要细胞类型及其亚型，并通过标记基因对关键的细胞类型进行了功能验证，表征了它们的细胞形态结构，揭示了大脑皮层各区域发育成熟的时序差异。

② 鉴定出NPC_1（neural progenitor cell，NPC）细胞为心室径向胶质细胞，NPC_2细胞为前体sub-RGs（oRGs），NPC_4细胞为中间祖细胞，并检测到一个新的、人类特有的瞬时NPCs亚群（NPC_3），该亚群特异性地富集在11~14孕周胚胎皮层的增殖区域。

③ 在24周的FL神经元中检测到动作电位信号，说明FL神经元较PL、TL、OL更早具备了电生理活性。

④ 大脑皮层和pons神经元在分子调控和发育模式上表现出明显的时空差异，其中pons神经元发育和成熟的更早。

⑤ 通过人和小鼠大脑皮层发育过程比较，发现两者皮层细胞发育模式保守，并且NPC_3和内皮信号基因APOLD1是人类特有的。（刘卓雅）

胚胎脑组织样本采集和数据分析示意图

Single-cell transcriptome analysis reveals cell lineage specification in temporal-spatial patterns in human cortical development.

2020.08.21；DOI: 10.1126/sciadv.aaz2978

研究文章；人，大脑皮层，脑干，神经细胞，发育，scRNA-seq；Xiaoying Fan, Yuanyuan Fu, Xin Zhou, Le Sun, Ming Yang, Jie Qiao, Xiaoqun Wang, Fuchou Tang; 北京大学，北京大学第三医院，中国科学院生物物理研究所；中国

胎儿肺

Fetal Lung

人类胎儿肺细胞图谱揭示近端-远端轴分化轨迹和上皮细胞命运相关的关键调节因子

Cell [IF：66.850]

① 联合使用scRNA-seq、scATAC-seq、高通量空间转录组学和单细胞成像技术，分析来自受孕后5~22周（pcw）人类胎儿的肺组织，绘制了人类胚胎肺发育的多组学细胞图谱（https://lungcellatlas.org），揭示了发育过程中不同细胞类型的细胞谱系轨迹，为成人肺部疾病进展的研究提供了新见解。

② 在胚胎肺组织中识别出144种细胞状态/类型，包括以前未识别的祖细胞状态、过渡细胞类型和与人类小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）亚型相关的神经内分泌（neuroendocrine，NE）细胞亚型。

③ 发育气道中存在两种神经内分泌细胞亚型：经典肺NE细胞（GRP+）和GHRL+NE细胞（TTR+、GHRL+）；在肺发育的所有阶段，细胞都在分化之前从尖端进入柄状态，并遵循mid-tip → late-tip →late-stalk → AT1/AT2细胞的分化轨迹。

④ 气道和外膜成纤维细胞均表达独特的信号分子组合，并在邻近的气道上皮或血管内皮与分布广泛的肺泡成纤维细胞之间形成物理屏障。

⑤ 使用该肺细胞图谱预测了肺祖细胞状态、信号相互作用和定义转录因子的谱系，并展示了如何使用人类胎儿肺类器官模型进行有效地测试。（邢雅楠）

人胚胎肝组织的多组学分析与主要发现

A human fetal lung cell atlas uncovers proximal-distal gradients of differentiation and key regulators of epithelial fates.

2022.12.08；DOI：10.1016/j.cell.2022.11.005

研究文章；人，胚胎，肺，神经内分泌细胞，肺泡成纤维细胞，发育，scRNA-seq，scATAC-seq，空间转录组；Peng He, Kyungtae Lim, Dawei Sun, Emma L. Rawlins; Wellcome Sanger Institute, European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI), University of Cambridge; UK.

产前心脏

Fetal Heart

人类早期产前心脏发育中心肌细胞的高度异质性

iScience [IF：6.107]

① 综合单细胞和空间转录组学分析，以及空间共定位细胞类型之间的配体-受体串扰分析，对受孕后6.5~7周的人类产前心肌细胞进行鉴定，发现早期产前人类心脏中心肌（cardiomyocytes，CMs）细胞具有高度异质性、独特的位置依赖特性和复杂的配体-受体串扰。

② 识别出8种发育中的CMs类型，这是人类发育细胞图谱（Human Developmental Cell Atlas）中确定的CMs的两倍多。

③ CMs在细胞周期活性、线粒体含量和连接蛋白基因表达方面具有高度变异性，并差异分布在心室（包括流出道）和心房（包括窦房结）中。

④ CMs配体-受体的串扰主要与非CMs类型有关，包括与心脏发生相关的通路。（Lina）

试验设计与主要发现

High cardiomyocyte diversity in human early prenatal heart development.

2022.12.20；DOI：10.1016/j.isci.2022.105857

研究文章；人，胚胎，心脏，心肌细胞，异质性，发育，scRNA-seq，空间转录组，配体-受体串扰；Christer Sylvén, Stefania Giacomello; Karolinska Institute, KTH Royal Institute of Technology; Sweden.

胎肝

Fetal Liver

单细胞时空转录组技术揭示胎造血干细胞扩增功能单元及其分子机制

Cell Research [IF：25.617]

① 利用scRNA-seq和空间转录组（包括华大自主研发的时空组学技术Stereo-seq）联合分析，绘制了小鼠胎肝（fetal liver，FL）发育的单细胞时空转录组图谱，解析了造血干/祖细胞的转录组和功能异质性，鉴定了新型的造血干细胞扩增的功能单元（HSC ‘pocket-like’ units，HSC PLUS）并揭示了其分子机制。

② 通过scRNA-seq构建了E11.5、E12.5、E13.5、E14.5四个时期发育中FL单细胞转录组图谱，并发现CD93不仅是表征造血干细胞和多能祖细胞（HSC/MPP）异质性的表面标志物，而且在功能上也是FL HSC/MPP发育所必需的。

③ 使用CellPhoneDB方法构建了HSC/MPP-niche细胞相互作用网络，鉴定了潜在的促造血干细胞扩增分子。

④ 利用空间坐标特征将微环境细胞与HSC/MPP的空间关系分为intra-spots（关系最密切）、inter-spots（关系密切）和others distant spots（关系疏远）三类，揭示了互作细胞和配对信号分子的空间关系。

⑤ 巨噬细胞通过形成一种“口袋状”的结构来促进HSC/MPP的扩增，进而定义了造血干细胞扩增的基础功能单元（HSC PLUS）。

⑥ 跨物种分析和功能验证表明，小鼠和人胎肝HSCs/MPPS之间存在保守的细胞间相互作用和扩增机制，但转录组特征存在差异。（王冰/赵瑞珍/刘传军）

FL组织的处理、细胞分离和scRNA-seq分析示意图

Identification of HSC/MPP expansion units in fetal liver by single-cell spatiotemporal transcriptomics.

2021.08.02；DOI：10.1038/s41422-021-00540-7

研究文章；小鼠，胚胎，肝脏，造血干细胞，扩增单元，scRNA-seq，空间转录组，Stereo-seq；Suwei Gao, Qiang Shi, Feng Liu, Cheng Li；中国科学院动物研究所，中国科学院大学，北京大学；中国

胎儿消化道

Fetal Digestive Tract

胎儿消化道发育的单细胞转录组图谱

Nature Cell Biology [IF: 19.064]

① 采用scRNA-seq分析来自人妊娠6~25周（估计受精时间后数周）的胚胎中食道、胃、小肠和大肠，以及2个成人的大肠组织，共获取到5,277个单细胞，定义了40种不同的细胞类型（胚胎发育阶段30种，成人大肠10种），阐明了4种器官在人类胚胎发育过程中的基因表达图谱及其信号调控机制，不同细胞类型的精准发育路径和基因表达特征，并进一步详细解析了大肠发育、成熟的路径和关键生物学特征。

② 胚胎发育早期（6~11周），消化道是以干、祖细胞的快速增殖和保持未分化状态为主要特征，中期（12~18周）初步建立了消化功能和免疫功能，晚期（19~25周）主要以组织细胞的结构特化和消化吸收功能特化和成熟为主要特征。

③ 胚胎发育早期4个消化道器官的基本基因表达特征仍然非常相似（仅259个差异表达基因），而发育晚期差异较大，差异表达基因增加到1,193个。

④ 发育晚期大肠中的细胞类型以及其基因表达模式与成年人阶段已经很接近，其中一些特定细胞类型的关键基因的表达也趋于一致，说明在胚胎晚期大肠的主要细胞类型可能已具备了初步的食物消化和营养吸收功能。（逄慧/Lina）

scRNA-seq实验和生物信息学分析工作流程图

Tracing the temporal-spatial transcriptomelandscapes of the human fetal digestive tract using single-cell RNA-sequencing.

2018.05.25；DOI：10.1038/s41556-018-0105-4

研究文章；人，胚胎，食道，胃，小肠，大肠，scRNA-seq；Shuai Gao, Liying Yan, Rui Wang, Jingyun Li, Hao Ge, Jie Qiao, Fuchou Tang; 北京大学第三医院，国家辅助生殖与优生工程技术研究中心和生殖内分泌教育部重点实验室，北京大学；中国