聚乙烯塑料的微生物降解

聚乙烯(polyethylene，PE)是一种以乙烯为原料经加成聚合制得的热塑性树脂。PE由非极性的饱和高分子量烃链组成，而烃链的对称分子结构又易于有序排列形成结晶态的超分子结构。这些特殊的物理化学结构赋予PE优异的机械性能和化学稳定性。自1944年，PE被美国DuPont公司实现大规模商业生产以来，其逐渐被广泛应用于生产生活中，并成为最常见的塑料之一。根据聚合方法、分子量高低、链结构之不同，PE可分为高密度聚乙烯(high density polyethylene，HDPE)、低密度聚乙烯(low density polyethylene，LDPE)及线性低密度聚乙烯(linear low density polyethylene，LLDPE)。2018年，全球塑料产量达到3.6亿t。其中，中国和欧盟分别占到了30%和17%。

PE的主要用途是一次性包装材料(包括塑料袋及容器)和农用薄膜等。PE塑料制品的大量消费，必然产生大量的PE塑料废弃物。现有的塑料废物处理途径主要是填埋和焚烧[1]。但是，填埋会占据土地、产生渗漏液及污染地下水；焚烧会产生大量的有毒气体，包括一氧化碳、氯化氢、二氧化硫、二噁英等[2]；热机械回收处理会导致回收塑料性能的下降。大量未被合理处理的塑料进入自然环境中，给环境生态和人类健康构成很大的威胁[3]。

自20世纪70年代以来，一些研究陆续报道了PE塑料被微生物降解的现象，并且从土壤、垃圾堆置点、海洋、昆虫肠道等不同生境中分离出若干能利用PE为唯一碳源生长的菌株[4-5]，为处理PE塑料废弃物提供了全新的思路。本文简述目前国内外关于PE降解菌株的分离、筛选以及降解酶方面的研究进展，以期为进一步研究PE塑料的微生物降解机理和处理技术提供参考。

PE降解微生物一般使用传统的微生物学方法进行分离，包括富集、分离、纯化和筛选几个步骤(图 1)。选用有PE降解微生物发现潜力的环境样品为接种物，将其加入以PE为唯一碳源的液体培养基中，在适宜的培养条件下进行微生物的富集。微生物生长旺盛时，将样品梯度稀释涂布在富营养固体培养基上，再选取单个菌落进行单独划线分离。提取纯化的PE降解潜力的单菌的DNA，进行16S rRNA基因扩增和测序，确定单菌的分类和进化关系。从分离获得的纯菌中，通过生理生化特性和被菌株降解后PE的材料性质等两方面的评价分析，筛选PE降解菌株[1, 5-8]。

该方法主要是通过观测菌株在以PE为唯一碳源培养条件下的生长动力学、细胞活性和酶活性质，判断微生物是否具有降解PE的能力。比如，采用细胞计数的方法[5]，观察微生物在以PE为唯一碳源的培养基上的生长情况，可作为其是否具有降解PE的依据[9]。

此外，也可以采用Live/Dead染色试剂(Thermo Fisher)和荧光显微镜观察鉴定微生物细胞是否存活，以此来判断菌株是否能利用PE为唯一碳源生长[10]。Live/Dead荧光染色剂主要包括碘化丙锭(propidium iodide，PI)和二乙酸荧光素(fluorescein diacetate，FDA) 2种化合物。微生物细胞染色以后，如果细胞死亡或细胞膜不完整，导致PI进入细胞与DNA相结合，在488 nm的激光激发下发射波长660 nm红色荧光，说明该微生物无法在这种以PE为唯一碳源的条件下生长；如果细胞具有正常活性，则FDA能够进入细胞，在活细胞非特异性脂酶的催化下生成荧光素，后者经480 nm激光激发出波长530 nm左右的绿色荧光，说明该微生物能够在以PE为唯一碳源的条件下生长。这种方法的优点是能通过直观的结果判断微生物是否能有效利用PE为唯一碳源生长。

基于观察微生物以PE为唯一碳源的生长状况，理论上可直观判断该微生物是否具有降解PE塑料的能力。但值得注意的是，在当前的研究中，一般采用的都是包含有机添加剂和低聚物分子的商品化PE塑料，导致不能区分微生物生长实际利用的碳源是来自PE塑料中的有机添加剂或者低聚物分子还是PE塑料本身。因此，在将来的研究中，有必要采取如萃取的办法尽可能去除PE塑料中的有机添加剂或者低聚物分子，或者合成制备窄分子量分布且不添加任何助剂的纯PE作为实验标准品，这将有利于排除实验中的假阳性。

另一方面，通过分析PE材料本身性质在被微生物降解前后的变化，如重量损失、矿化(转化成CO2)、表面物理化学性质变化、分子量分布及大小变化和产物生成等，可评价生物降解的效果(图 1)。

首先，最简单的就是测定材料在降解前后的重量损失，通过重量损失的数据判定生物降解是否有效[11]。此外，采用Sturm Test，即在有氧条件下，通过测试微生物以PE为唯一碳源产生CO2的量判断PE被微生物降解的效率[12-13]。与观察微生物以PE为唯一碳源的生长状况时面临的问题一样，当前研究中一般采用的都是包含有机添加剂和低聚物分子的商品化PE塑料。通常，这些有机添加剂和低聚物的含量并未注明，这使得不能区分PE塑料的重量损失以及产生的CO2是来自有机添加剂或者低聚物的降解还是PE塑料本身。通过同位素示踪的方法，用放射性14C标记PE中的C，利用闪烁计数器测量降解实验过程中产生的14CO2来确定PE的降解效果[14]。这一方法也被认为是判断生物降解效率的金标准。不过，由于制备放射性14C标记PE相对比较复杂且尚无可购买的商业化产品，进行放射性示踪实验也需要相应的防护要求，导致这种方法比较难以推广。采用稳定同位素13C标记的PE开展示踪实验，虽然能购买到商业化产品(Thermo Fisher)，实验中也不需要放射性防护，但是通过同位素质谱检测13CO2容易做到定性分析却难以定量检测，一般很少采用。

利用凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography，GPC)测定材料在被微生物降解前后的分子量分布和平均分子量的变化，可以判断PE被微生物降解后，是否发生了长链的解聚[5]。比如，用GPC检测被微生物降解之后的PE塑料，与降解前的原样相比，分子量分布往高分子部分偏移且平均分子量增加，这说明被微生物降解的部分是分子量相对较低的寡聚物分子或者是有机小分子添加剂，大分子链并没有发生解聚[1, 5]。反之，如果分子量分布往低分子部分偏移且平均分子量降低，这说明大分子链发生了解聚[5]。因此，采用GPC测定分子量分布和分子量大小，应作为不可或缺的佐证来评价PE塑料降解之后的重量损失或者产生的CO2是否是来自PE塑料高分子长链的解聚和降解[5]。在证明PE长链发生解聚的基础上，利用气相和液相色谱与质谱联用的方法分析降解过程中产生的代谢产物，也是表明降解效果的一个重要的依据[14]。

利用扫描电子显微镜(scanning electronic microscope，SEM)和原子力显微镜(atomic force microscope，AFM)观测PE膜在降解前后表面物理形貌和粗糙度的变化，比如明显的损伤和凹坑等，可以直观地看到生物降解的效果[5]。通过观测材料表面化学性质的变化也是评定降解效果的方法之一，如采用全反射-傅立叶变换红外光谱(attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy，ATR-FTIR)可以测定材料中含氧极性基团的产生，采用X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)可以检测是否被引入了氧元素，测定表面水接触角来判断PE材料表面的亲疏水性变化[5]。但是，在进行表面物理形貌的观测时，要保证未经微生物降解的PE塑料表面处于光滑和无损状态，避免PE塑料本身的表面损伤被误判为降解特征。在进行表面化学性质的检测时，要设置好对照实验并做好表面的清洁，避免将吸附在PE塑料表面的生物分子如蛋白、脂肪和核酸等物质引入的含氧基团误判为PE塑料的降解特征。

如上所述，通过微生物富集和分离纯化，结合微生物生理生化和材料性质表征的筛选方法，可以得到具有PE降解能力的微生物。但是，当前的方法也存在一些缺陷，容易导致假阳性降解表型的菌株。

在未来的研究中，首先需要解决的问题是规范降解实验所采用的PE塑料底物。目前已经报道的研究中所采用的PE塑料底物五花八门，寡聚物分子或者是有机小分子添加剂含量未知，分子量分布相对较宽。在规范PE塑料底物的基础上，重点关注的实验证据应主要包括三方面：(1)微生物的生长：在以纯PE标准品为唯一碳源时，能观测到明显的微生物增长。(2)重量损失：在以纯PE标准品为唯一碳源时，根据聚酯的微生物降解的效率来看，在28 d内，建议以重量损失效率达到15%-20%以上视为可靠。(3)同位素示踪：在有条件的情况下，采用14C标记PE实验是验证表型的金标准，同样建议在28 d内，14CO2损失效率达到15%-20%以上视为可靠。其次，应该建立菌株保藏机制。凡是公开发表的PE塑料降解菌株，有必要要求在可公共获取的菌株保藏机构中进行保藏并在公开发表的论文中公开保藏号，以便不同的研究人员对菌株降解效果进行比较和参照。此外，以PE为唯一碳源的筛选方式也存在微生物生长速率慢、实验周期长的问题。之后的研究可以尝试开发以小分子类似物为底物的高通量筛选方法进行初筛，再用传统的方法进行复筛，提高降解PE微生物的筛选效率。

土壤中的微生物非常丰富，通常1 g土壤中有106-109个微生物，其种类和数量随成土环境及其土层深度的不同而变化[15]，所以选用这种资源丰富的生境作为PE降解菌的筛选来源之一(表 1)。1978年，Albertsson[16]用放射性14C标记合成的PE薄膜作为底物，考察了土壤微生物对PE的降解能力，在2年内，通过闪烁计数器测量释放14CO2的净值约占测试样品中放射性总量的0.5%，明显高于老化样品非生物产生的14CO2，这证明土壤微生物对PE进行了催化转化。1990年，Albertsson等[34]又利用土壤中的真菌测试了微生物降解PE的能力，同位素示踪和红外光谱测定数据都表明PE在土壤真菌的作用下产生了有效的降解。1999年，Kawai等[35]利用光降解后的PE和商业PE蜡分别作为唯一碳源和能源培养土壤微生物，通过活细胞计数、样品重量和GPC分析分子量的变化，证实了土壤微生物菌群的生物降解作用。2004年，Gilan等[17]用PE薄膜作为唯一碳源，从土壤样本中富集分离了一株细菌Rhodococcus ruber，在液体培养中，该菌在PE表面上形成生物膜[18]，并在孵育30 d之内产生了8%的重量损失。2013年，Tribedi等[19]从土壤中富集分离得到一株Pseudomonas属细菌，在不需要事先氧化预处理PE的情况下，45 d内PE的重量损失可达到4%-6%，降解后PE材料的疏水性经测量也有一定降低。2016年，Kowalczyk等[36]从土壤中分离出新的菌株，并通过分析16S rRNA基因序列进行了菌种鉴定，还以PE薄膜为底物进行降解实验，用ATR-FTIR和SEM分析了PE薄膜样品，结果表明PE薄膜的表面物理化学结构产生了明显变化，还检测到了约9%的重量损失。2017年，Peixoto等[20]从当地的土壤中发现的塑料碎片中分离了9种新型的PE降解细菌，在以PE为唯一碳源培养90 d后，这些来自Comamonas、Delftia和Stenotrophomonas属的细菌显示出代谢活性和细胞活力；此外，ATR-FTIR检测表明，生物降解后的PE经历了氧化，并新生成了羰基等极性基团。AFM和SEM证实了表面粗糙度的显著变化和PE表面的巨大破坏。

海洋约占地球表面积的71%，海洋微生物分布广、数量多，是微生物的资源库之一。2008年，Sudhakar等[11]以不同底物设立3个实验组，分别是未经预处理的LDPE和HDPE、热处理后的LDPE和HDPE，以及未经预处理的淀粉共混LDPE，选择了2种海洋微生物Bacillus sphericus和B. cereus，在pH 7.5和温度30 ℃的条件下利用3个实验组的材料作为唯一碳源，进行历时1年的降解实验，结果发现，在B. sphericus的作用下，热预处理的LDPE和HDPE样品的重量损失分别约为19%和9%，而未经预处理的样品分别为10%和3.5%。之后，Harshvardhan等[21]从浮游水域分离出60种海洋细菌，并从中筛选出了3种具有降解LDPE的能力菌株，这3株菌能够在以PE为唯一碳源的培养基中生长；基于16S rRNA基因序列同源性，3株菌分别被鉴定为Kocuria palustris、B. pumilus和B. subtilis；与这3株菌共同培养30 d后，PE的失重分别为1%、1.5%和1.75%；通过ATR-FTIR光谱测定，发现酮基羰基键指数(ketone carbonyl bond index，KCBI)、酯基羰基键指数(ester carbonyl bond index，ECBI)和乙烯基键指数(vinyl bond index，VBI)增加，进一步证实了PE的生物降解。2019年，Delacuvellerie等[22]研究了以LDPE、聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate，PET)和聚苯乙烯(polystyrene，PS)塑料为唯一碳源从海洋环境样品中富集潜在的可降解塑料细菌，在以这几种塑料为唯一碳源的情况下，结果表明细菌群落组成显然依赖于塑料种类，诸如Alcanivorax sp.、Marinobacter sp.和Arenibacter sp.这些可降解烃的细菌，在LDPE和PET中含量非常丰富，这表明这些细菌是塑料降解的潜在参与者，试验数据还首次显示了Alcanivorax borkumensis能够在LDPE上形成厚厚的生物膜并降解这种石油基塑料的能力。以上的研究都是从海洋中获得微生物资源，并证实了这些细菌对PE的有效降解。

2009年，Shah等[12]通过富集从粘附在PE碎片表面的污水污泥中分离出一种真菌菌株，用光学显微镜在塑料片的表面上观察了到厚厚的真菌菌丝网络，该真菌菌株被鉴定为Fusarium属；在30 ℃和150 r/min的基础盐培养基中共同培养2个月，在PE片表面观察到了明显的镰刀菌生长；通过SEM观察PE片时，发现表面产生了凹坑、裂纹和腐蚀；通过Sturm Test检测到降解过程中产生约1.85 g/L的CO2，而在对照实验中只产生0.45 g/L的CO2。2010年，Zahra等[9]从德黑兰一个市政垃圾填埋场采集的样品中分离出了包括Aspergillus fumigatus、A. terreus和F. solani在内的真菌，这些真菌可通过在培养基中形成生物膜来降解LDPE。2010年，Balasubramanian等[23]从马纳尔湾的塑料垃圾场中分离出15株细菌(GMB1–GMB15)，基于它们降解HDPE的效率，选择了GMB5和GMB7进行进一步研究，并将它们鉴定为节杆菌(Arthrobacter sp.)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)；孵育30 d后，Arthrobacter sp.作用的HDPE重量损失接近12%，而Pseudomonas sp.作用后重量损失15%；利用Live/Dead染色试剂细菌染色，发现接种后的2-5 d之间，2种细菌都显示出了显著的生长；ATR-FTIR光谱表明，KCBI、ECBI和VBI增加，证实了2种菌对PE的生物降解。2012年，Jeon等[37]从堆肥样品中分离出能够降解低分子量PE (low molecular weight polyethylene，LMWPE)的嗜热细菌，可将重均分子量(Mw)在1 700-23 700范围内的LMWPE矿化为CO2；LMWPE的生物降解性随Mw的增加而降低。由于降解后LMWPE的低分子量分数显著降低，并伴随Mw的增加，这表明低分子量部分被优先降解了。由于微生物的作用，ATR-FTIR检测发现了C–O的峰，表明发生了微生物诱导的氧化降解。2012年，Kyaw等[24]研究了4种假单胞菌细菌对LDPE的生物降解能力，ATR-FTIR光谱表明KCBI均有增加。2013年，Esmaeili等[25]从德黑兰的垃圾填埋场中富集筛选出具有出色降解LDPE能力的两种微生物，后续将这两株菌加入土壤中进行生物降解实验，过程持续126 d；在土壤中进行的CO2测量表明，未接种实验组的生物降解速度很慢，126 d后测得降解百分比约为7.6%和8.6%；相反地，在微生物存在的条件下，生物降解的百分比分别为29.5%和15.8%。2018年，Sarmah等[26]从丢弃在生活污水的PE手提袋中分离出2种主要的蓝细菌菌种，它们能够有效降解LDPE片材；通过FTIR、SEM、NMR及碳、氢、氮(carbon、hydrogen、nitrogen，CHN)元素含量等分析方法，了解PE的结构、形态和化学变化；CHN元素分析证实了PE中的蓝细菌物种的碳利用率约为4%，PE表面上蓝细菌物种的快速生长表明，微生物可以持续从PE中获取能量，依赖其生存；经蓝细菌处理后，PE的层状厚度、重量和结晶度均有降低；SEM和光学显微镜在表面上显示出大的凹槽，表明PE结构的显著破坏；FTIR光谱计算得出的键指数变化表明官能团和侧链特征发生变化，证明了PE的生物降解。2019年，Park等[27]调查了从城市垃圾填埋场沉积物中获得的嗜温混合细菌培养分离物对微型PE的分解，其中，Bacillus sp.和Paenibacillus sp.是最主要起降解作用的菌株，两种菌株的作用降低了颗粒的干重(60 d后为14.7%)和平均粒径(60 d后为22.8%，通过SEM分析获得)，在降解后PE颗粒的气相色谱-质谱分析中，从PE微塑料中洗脱出来的有机物数量和类型在分解早期较低，但是在后期阶段有所增加，表明微塑料通过酶处理作用发生链断裂。2020年，Li等[28]研究了Micrococcus hydrolysae的生长特性及其在LDPE生物降解中的应用，该菌株从富含木质素的海洋纸浆厂废物中分离得到，木质素是一种天然复合聚合物，与PE一样也含有饱和碳碳键；菌株培养30 d后，通过SEM观察到聚合物表面形态变化，ATR-FTIR表明聚合物链中其他羰基的形成，可以清楚地证明LDPE颗粒的生物降解。上面几种研究的微生物都来源于生活中产生的废弃物和污水等，这些来源的微生物已经被证明对PE有降解效果。

除了以上几种来源的微生物，学者也在昆虫肠道中发现了大量具有降解塑料能力的微生物资源[6, 38-39]。2014年，Yang等[5]从啮食PE塑料薄膜的蜡虫或印度粉蛾(Plodia interpunctella)的幼虫肠道中分离出了2种能够降解PE的细菌，在PE膜上将这2个菌株孵育28 d后，形成了生物膜，而且检测到膜的疏水性降低；使用SEM和AFM在PE膜的表面观察到明显的损伤，包括凹坑(深度为0.3-0.4 μm)；使用XPS和ATR-FTIR成像显微镜验证了羰基的形成；两种细菌(108 CFU/mL)的悬浮培养物在60 d的温育期内能够分别降解约6.1%±0.3%和10.7%±0.2%的PE膜(100 mg)，而且残留的PE膜的分子量较低，并且还检测到12种水溶性子产物的释放；结果证明了在蜡虫肠道中存在降解PE的细菌，并指出昆虫肠道可能是塑料降解菌株的重要来源。2018年，Lwanga等[14]从蜡虫肠道中分离出放线菌门的Microbacterium awajiense、Rhodococcus jostiii、Mycobacterium vanbaalenii和Streptomycesfulvissimus，以及硬壁菌门的B. simplex和Bacillus sp.，将这些细菌接种到经过伽马消毒的含有或不含有LDPE微塑料(microplastic，MP)的土壤进行降解实验，在细菌的存在下，LDPE-MP的粒径明显减小；另外，仅在同时含有细菌和LDPE-MP的处理中测量到了几种挥发性化合物，例如十八烷、二十烷、二十二烷和十三烷，表明这些长链烷烃是细菌LDPE-MP降解的副产物。2019年，Ren等[29]从大蜡螟(Galleria mellonella)的肠中分离出一株Enterobacter属细菌，经过14 d的培养后，PE膜周围形成了微生物菌落；通过SEM和AFM的观察，PE膜的表面上检测到了粗糙度、凹陷和裂缝；FTIR显示，经菌株处理后的PE膜上存在羰基官能团和醚基；液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS)还显示，由于微生物处理，某些醇、酯和酸的含量增加了，这表明用细菌处理过的PE膜表面发生了氧化反应。这些结果证实Enterobacter sp.具有降解PE的能力。2020年，Zhang等[30]从大蜡螟(Galleria mellonella)的肠道内容物中分离出了一株真菌Aspergillus flavus PEDX3，以HDPE为碳源培养28 d后，菌株PEDX3将HDPE颗粒降解为分子量较低的颗粒；FTIR结果显示了MPP的羰基和醚基的出现，这也证实了PE的降解；此外，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)研究了潜在的降解酶；最后，2个漆酶样多铜氧化酶(LMCOs)基因AFLA_006190和AFLA_053930在降解过程中显示出上调的表达，这可能是候选的PE降解酶。这些结果表明，Aspergillus flavus PEDX3具有降解PE的能力。肠道微生物是丰富的微生物资源库，昆虫肠道微生物对PE降解研究的进展迅速，更让我们有信心能够从中得到更高效环保的塑料降解方案。

其他未标明菌株来源的细菌也具有降解PE的能力。1998年，Albertsson等[31]将Arthrobacter paraffineus作用于经高温处理后的LDPE，经过3.5年的降解实验后，通过GC-MS在非生物样品中鉴定出一元和二元羧酸和酮酸的同源系列产物，而在生物环境中则观察到这些酸完全消失；对样品进行FTIR测试后，在生物降解样品中发现较少的羰基和更多的双键，这与PE的生物降解机理相符。2010年，Chatterjee等[32]将LDPE膜高压灭菌后覆盖在营养琼脂平板上，并接种Staphylococcal sp.，营养琼脂平板在2-3 d内显示出菌体的生长，通过SEM观察分析，支持菌体生长的PE膜有孔形成；在无机盐基本营养培养基中，切碎的LDPE作为其唯一碳源，可支持表皮葡萄球菌的生长；即使经过3个月的接种，该生物仍然可以生存，并且可以观察到切碎的塑料尺寸的逐渐分解。2017年，Paço等[33]评估了在寡营养培养基中Zalerion maritimum与PE颗粒作用不同时间的结果，通过ATR-FTIR和NMR评估了材料的分子变化，结果表明，在测试条件下，Z. maritimum能够利用PE，从而导致PE颗粒的质量和尺寸均减少。这表明这种天然存在的真菌可能对微塑料的生物降解有积极贡献，而且需要的养分最少。

以上研究表明了土壤、海洋和垃圾堆置点这些微生物含量丰富的生境中有降解PE微生物的存在，选择这些生境作为分离源对于能否得到目标微生物可能起着至关重要的作用。不过，目前可分离培养的微生物只占这些生境中微生物总量的很少一部分[40]，所以，从各个生境中获得更多可分离培养微生物，也是获取更多PE降解微生物的重要一步。

PE的微生物降解菌株资源在不断地丰富，对应PE降解酶的研究也有一些报道(表 2)。研究早期由于实验条件限制等原因，使用动物肝脏匀浆等生物材料直接作用于PE，后期将各种菌来源的酶进行表达纯化，再进行有关PE的降解研究。

1990年，Wasserbauer等[41]将细菌B. brevis和P. putida的菌体及动物肝脏分别制成匀浆，用匀浆处理了PE，经过FTIR测定后，发现材料被引入了含氧极性基团。由于选用的微生物和动物肝脏匀浆都是单加氧酶含量较高的材料，为了证明PE的氧化降解是否与单加氧酶有关，Wasserbauer等又分别在反应体系中加入了可以激活和抑制单加氧酶活性的苯巴比妥和细菌内毒素，单加氧酶在受到激活后氧化现象更加明显，而受到抑制之后PE被氧化程度减少了，这项实验证明了PE的氧化降解是由于微生物和动物肝脏匀浆中的单加氧酶成分。

1992年，Pometto等[48]将Streptomyces viridosporus、S. badius和S. setonii摇瓶培养后，制备了细胞外产物的浓缩物，将经10 d热处理(70 ℃)的淀粉-PE可降解塑料膜与活性或非活性酶一起孵育3周(37 ℃)，FTIR、机械性能和分子量分析结果表明，活性酶的作用能使PE薄膜产生降解。

2015年，Azeko等[49]介绍了细菌Serratia marcescens的上清液胞外酶促进PE的降解，并将其与直接暴露于菌液下的降解进行了比较，结果表明，无细胞提取物上清液降解LLDPE的速度要快于菌液，还通过SEM、差示扫描量热法(differential scanning calorimetry，DSC)和FTIR阐明了降解机理。这些方法表明S. marcescens及其上清液均降解LLDPE，LLDPE被微生物降解后，KCBI也有所增加，降解过程还导致了微孔的形成。

一些研究者选用过氧化物酶测定了其在PE降解中的功能。1998年，Iiyoshi等[45]在各种营养条件下，研究了木质素降解真菌IZU-154、Phanerochaete chrysosporium和Trarnetes versicolor对高分子量PE膜的降解作用，结果发现，在氮或碳限制的培养条件下，IZU-154在3种降解木质素的真菌中显示出最显著的PE降解；此外，对于P. chrysosporium和T. versicolor，向氮或碳限制的培养基中添加Mn(Ⅱ)可增强PE的降解；这些结果表明PE降解与木质素降解真菌的木质素分解酶活性有关；在Tween-80、Mn(Ⅱ)和Mn(Ⅲ)螯合剂的存在下，用部分纯化的锰过氧化物酶(MnP)处理PE膜会导致显著降解。该结果表明，MnP是木质素降解真菌降解PE的关键酶。

2004年，Zhao等[46]使用过氧化物酶作为催化剂和过氧化氢作为氧化剂进行酶表面改性，通过XPS、FTIR和SEM表征改性后HDPE表面的化学组成和形貌的变化，结果表明，酶处理后HDPE表面的O/C原子比增加，并且出现了新的官能团，例如–CO–；而且，经处理的HDPE膜表面相比未经处理的表面变粗糙，通过紫外可见光谱和接触角测量分析了处理过和未处理过的HDPE薄膜亲水性，发现HDPE与水的接触角减小，而表面对水溶性染料的吸附能力增强，这清楚地表明，酶处理可以显著提高HDPE膜表面的亲水性。

来源于假单胞菌的烷烃降解酶基因也被用于研究PE降解。2012年，Yoon等[42]将Pseudomonas sp. E4的烷烃羟化酶基因(alkB)在大肠杆菌BL21中表达，而重组大肠杆菌BL21在37 ℃的堆肥中进行80 d的生物降解期间，将LMWPE的19.3%的碳矿化为CO2，而非重组宿主细胞大肠杆菌BL21对LMWPE完全没有活性生物降解，表明来自假单胞菌属物种的alkB在LMWPE降解中起着核心作用。在之后的2015[43]和2016年[44]，这个团队又将P. aeruginosa E7来源的alkB在大肠杆菌中进行了表达，降解实验分别进行了80 d和50 d，降解后材料表面有不同程度的蚀刻，以上成果表明了alkB对低分子量的PE降解的能力。

漆酶也被报道可能是一种具有PE降解能力的酶。2012年，Santo等[47]报道了细菌铜结合酶漆酶在PE降解菌株Rhodococcus ruber氧化和降解PE中的作用，发现铜显著影响漆酶的诱导和活性，导致PE降解；通过RT-PCR进行的mRNA定量显示，与未处理的对照相比，铜处理的培养物中漆酶mRNA水平增加了13倍；与未修饰的对照相比，向含有PE的R. ruber培养物中添加铜可将PE的生物降解率提高75%；此外，当从铜诱导的细胞培养基中收集到漆酶的胞外亚型时，将其与PE一起温育，该聚合物的重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)分别降低20%和15%；用细胞外漆酶孵育的类似PE薄膜的FTIR分析显示羰基峰增加，表明漆酶的酶促氧化作用在PE的生物降解中起主要作用。

已有报道分别从土壤、海洋、废弃物堆置点、昆虫肠道等微生物种类丰富的生境中分离得到了大量的PE降解微生物资源，并发现一些单加氧酶、过氧化酶和漆酶具有氧化降解PE的能力。这些研究为进一步研究PE的生物降解机制和发展PE的微生物降解处理技术提供了依据。不过，要进一步推进PE微生物降解的研究，还需要在以下方面有所突破：

(1) 完善PE降解菌株分离和筛选方法，确认菌株的降解表型。当前研究中一般采用的都是包含有机添加剂和低聚物分子的商品化PE塑料，导致不能区分PE塑料的重量损失以及产生的CO2是来自有机添加剂或者低聚物的降解还是塑料本身。所以应该规范降解实验PE塑料底物为窄分子量分布且不添加任何助剂的纯PE标准品，在此基础上，根据微生物生长、重量损失及同位素示踪实验(建议28 d降解率大于15%以上)等实验证据，完全确认降解表型。

(2) PE在常温下是以半结晶型的凝聚态存在，结晶域的有序结构限制了分子链的运动能力，从而降低接触酶的机率和降解反应速率。要研究调控凝聚态结构的方法，突破分子链运动的限制，进而大幅提高生物降解效率。

(3) 在上述工作取得突破的基础上，以确认的高效降解菌株为对象，借助高通量组学技术并结合微生物分子生物学方法，将有望逐步阐明PE降解过程的微生物代谢网络特点，明确关键功能基因或蛋白质。

(4) 借助蛋白质工程和合成生物学技术手段，通过改造PE降解酶和代谢途径设计，构建高效的人工合成微生物。同时应进一步探索更适合微生物生长和降解的条件，尝试多菌种复合降解，以提高降解效率。