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凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种. 一、琼脂糖凝胶电泳: 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和 鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度, 把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为62~65℃,溶解后在 37℃下维持液体状态约数小时,主要用于DNA片段的回收,质粒与外源性DNA的快速连 接等. (一)凝胶浓度 凝胶浓度的选择依DNA分子的大小而定. 琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围 琼脂糖浓度(%) 线型DNA 分子的分离范围(Kb) 0.3 5 ~60 0.6 1 ~20 0.7 0.8 ~10 0.9 0.5 ~7 1.2 0.9 ~6 1.5 0.2 ~3 12.0 0.1 ~2(二)电泳缓冲液 核酸电泳缓冲液有三种,即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE 与TPE缓冲容量高,DNA分离效果好,但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高,容易使 DNA沉淀.TAE缓冲容量低,但价格较便宜,因而推荐选用TBE.缓冲液中的EDTA可螯合 二价阳离子,从而抑制DNA酶的活性,防止PCR扩增产物降解. 10XTBE缓冲液的配制 Tris硷,108克 EDTA,9.3克 硼酸,55克 H2O至,1000ul (其PH应为8.0~8.2) 临用时用水稀至0.5XTBE(20倍稀释. (三)核酸电泳的指示剂与染色剂 1.指示剂:核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中 呈紫兰色,在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中,溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色,它在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时,其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似. 指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有①增加样 品密度,使其比重增加,以确保DNA均匀沉入加样孔内.②在电泳中形成肉眼可见的指 示带,可预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色,使加样操作更方便. 染色剂:核酸电泳后,需经染色后才能显现出带型,最常用的是溴化乙锭染色法,其 次是银染色. 溴化乙锭(ethidium bromide,EB)是一种荧光染料,EB分子可嵌入核酸双链的碱基对 之间,在紫外线激发下,发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml的EB,有时亦可在电泳后,将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10~15min.琼脂 糖凝胶EB染色,肉眼可见核酸电泳带,其DNA量一般>5ng,当溴化乙锭太多,凝胶染 色过深,核酸电泳带看不清时,可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察. 银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物,然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒,可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后,DNA不宜回收. (四)电泳 1.电泳装置: 电泳装置主要有电泳仪,电泳槽及灌胶模具等. 2.电泳方法: (1)用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净.放在水平桌面上,并架好梳子. (2)根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶,一般200~400bp的DNA片段, 可配制1.2~1.7%浓度的琼脂糖用于电泳. 3.配制0.5XTBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中,称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅 或微波炉内加热熔化.冷却至60℃(需要时可加入溴乙锭),倒入电泳槽中,待凝固. 4.向电泳槽中倒入0.5XTBE,其量以没过胶面2mm为宜,小心移去梳子.如样品孔内有 气泡,应设法除去. 5.在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液,混匀后,加入样品孔内. 6.接通电源,一般红色为正极黑色为负极,切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样 孔的一端为负).电压为1-5V/cm(长度以两个电极之间的距离计算). 7.根据指示剂泳动的位置,判断是否终止电泳.一般200~400bp的PCR产物50V电压, 电泳20~40min即可. (3)溴化乙锭染色后,紫外仪上观察电泳带及其位置,并与核酸分子量标准比较被扩 增产物的大小. 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分 析.其装载的样品量大,回收DNA纯度高.长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸 分子即能分离. 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体,在催化剂TEMED(N,N,N,N'一四甲基乙二胺)和 过硫酸铵的作用下,丙烯酰胺聚合形成长链,聚丙烯酰胺链在交联剂,N,N'一亚甲 双丙烯酰胺参与下,聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶. 聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的,不同浓度丙烯酰胺和DNA的 有效分离范围见表2. 丙烯酰胺(%) 有效分离范围(bp) 溴酚兰* 二甲苯青* 3.5 100 ~2000 100 460 5.0 80 ~500 65 260 8.0 60 ~400 45 160 12.0 40 ~200 30 70 15.0 25 ~150 15 60 20.0 10 ~100 12 45* 表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA 分子所含碱基对数目(bp). (一)材料 1.电泳仪器:电泳仪,垂直电泳槽及其附件. 2.30%丙烯酰胺 丙烯酰胺,29克N,N'一亚甲基双丙烯酰胺,1克 H2O,加至100ml 装于棕色瓶内,4℃可保存二个月. 3.10%过硫酸铵 过硫酰铵,1克 加水至,10ml 4℃可保存一周,-20℃可保存一个月. 4.1XTBE电泳缓冲液 5.TEMED(四甲基乙烯基二胺) (二)聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积,配制聚丙烯酰胺凝胶. 1. 按要求装配好垂直电泳板,两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂 糖封边,防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出. 2. 将装好的玻璃电泳板倾斜成45~60℃角. 3. 按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数. 4. 加入TEMED后,立即混匀,缓缓倒入两玻璃板间的胶床中,直到液 体接近溢出时为止. 5. 立即插入适当的梳子,密切注意防止梳齿下产生气泡,用一有力 的夹将梳子夹在一边的玻璃板上,然后将玻璃板斜靠在物体上,使 成10°角,可减少液体泄漏的机会. 6. 室温聚合一小时后,将玻璃板插入电泳槽中,上紧,倒入0.1XTBE 缓冲液. 7. 小心取出梳子,立即用缓冲液冲洗加样孔,因为梳子取出后,梳 子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合,产 生不规则的表面,将导致以后DNA电泳带型不规则. 8. 将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后,加到样品孔内,加样时不 要产生气泡. 9. 接好电极,电压为1-8V/cm,进行电泳. 10 .根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳. 11 .电泳毕,切断电源,弃去电泳仪,取出胶床板,小心移去一块玻 璃板,让凝胶吸附在另一块玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶 液中,15~30min后取出水洗紫外仪下观察结果. 12 .聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出>10ng以上量的DNA条带.要求更高 的灵敏度,可用银染. 生物试剂库: 试剂库 :http://www.bioon.com.cn/reagent/ 超过20万种试剂产品,包括化学试剂,分子生物学试剂,细胞生物学类试剂 PCR系列栏目 : PCR/RT-PCR/qPCR 琼脂糖凝胶消化 PCR方法相关产品: 限制性内切酶 PCR克隆试剂盒 常用克隆载体 克隆试剂盒 AFLP分析 SNP基因分型 RACE试剂盒 SAGE 试剂盒 电泳设备 紫外设备 普通PCR仪 定量PCR仪 PCR/RT-PCR/qPCR试剂 PCR引物 PCR试剂 PCR对照 特异性PCR试剂盒 PCR克隆试剂盒 RNA RNase检测/去除 RT-PCR试剂 RT-PCR标准品 定量PCR试剂 定量PCR标记 总RNA分离纯化盒 PCR产物纯化 核酸酶 聚合酶 反转录酶
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