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拭去第一滴血后,用微量吸管准确吸血到10ul处,拭去管尖余血,将吸管插到稀释液中迅速的把血液放出,并用上清夜洗净洗管内残存血液,立即轻轻振荡混匀,用消毒干棉球按压穿刺伤口。 4.进一步混匀红细胞悬液,然后用尖吸管吸取数滴(或用细玻璃醮取一滴),充入计数室内准备计数。 充细胞悬液时应防止产生气泡,要一次充好,液量多少适宜。 水平位静置2~3min待细胞沉下。 5.将计数板平放于显微镜载物台上,用低倍镜找出红细胞计数区域,如红细胞分布均匀即可于低倍镜下进行计数。 计数中央大方格中的四个角和中心的五个中方格内的红细胞。 为保证计数的准确,凡在中方格双线上的红细胞按压左侧及上侧线者计入,按右侧及下侧线者弃去的原则进行计数(图4) 图4红细胞计数方式 6.将五个中方格内红细胞数×5×10×200×106=5个中方格内红细胞数×1010=红细胞数/L,报告方式: △、△△1012/L。 上式中 ×5表示把5个中方格内红细胞数折算为1个大方格的红细胞。 ×10表示把一个大方格容积(0.1ul)折算成1ul。 ×200表示血液稀释倍数。 ×106表示将ul换算成L。 △△1012/L表示将红细胞数以小数点前保留1位数字乘以1012形式报告。 如数得红细胞为450个则报告为4.5×1012/L。 [注意事项] 1.取血部位的皮肤必须正常,凡局部有水肿、发炎、紫绀或冻疮等均不可穿刺采血。 2.一人一针,防止交插感染。 穿刺必须够深,使血液自行流出或仅施压力即可流出。 3.微量吸管的容量必须准确,内腔一定要干燥,否则会影响吸血量和导致溶血。 4.取血动作必须迅速,否则常易凝固。 若作血红蛋白或红细胞计数两项时,应先取红细胞计数的标本,后取血红蛋白的标本。 5.充液之前务必充分混匀,否则因久置而红细胞下降,导致计数值错误的偏低。 6.一般于低倍镜下计数即可。 为区别异物或残渣,将可疑目标置低倍镜视野中心,然后转高倍镜观察。 7.在红细胞稀释中,白细胞仍然存在。 但因在正常人血液中,红细胞于白细胞之比是750: 1,又经200倍稀释故对红细胞计数影响不大。 但如遇白血病患者,其白细胞明显增多时,则应进行校正,可从上法所得的红细胞数值(内含较多白细胞)中减去白细胞计数值。 8.如遇高球蛋白血症病人,其血液加稀释液后,迅速出现颗粒状混浊,乃因氯化高汞将球蛋白沉淀所致。 此时可换用生理盐水作稀释液,但应及时计数。 9.如遇含高效价冷凝集素的病人,当血加入稀释液后,其红细胞即凝集成红色颗粒状,此时应事先将红细胞稀释液管加温后再放入血液或将红细胞悬液管置温箱内待冷凝现象消失后再迅速混匀计数。 [参考值] 成年男性(4.0—5.5)×1012/L 成年女性(3.5—5.0)×1012/L 初生儿(6.0—7.0)×1012/L 二血红蛋白测定(hemoglobindetermination) [要求]通过实习熟练掌握采血技术,能进行血红蛋白测定。 并记住参考值和临床意义。 [原理]血红蛋白被高铁氰化钾氧化为高铁血红蛋白(Hi),再与氰结合成稳定的棕红色氰化高铁血红蛋白(HiCH)。 在特定波长和光径(比色杯内径)条件下具有一定的吸光度,据此即可求的血红蛋白浓度(g/L)。 [仪器、试剂] 仪器微量吸管 粗口径清洁试管 消毒采血用具 721分光光度计 试剂VanKampen-Zijlstra(文齐氏)液(HiCH转化液) 氰化钾(KCN)0.05g 高铁氰化钾[K3Fe(CN)6]0.20g 无水磷酸二氢钾(KH2PO4)0.14g TritonX-100(或其他非离子表面活性剂)1.0g 蒸馏水加到1000ml 上述试剂为淡黄色溶液储存棕色瓶中室温妥善保存,其中非离子表面活性剂可加速溶血。 缩短转化时间,防止因血浆蛋白改变引起的浑浊。 [方法] 1.取转化液5ml于粗口径试管中加血20ul混匀,室温(20℃-25℃)静置5min。 2.以校正过波长和灵敏度的分光光度计,波长为540nm,光径1cm,以转化液为空白,测定吸光度(A) 3.血红蛋白g/LA540/44×1.0×64458/1000×251=A540×367.7 上式中: (1)44为国际血液学标准化委员会(ICSH)公布的血红蛋白在540nm波长下的毫克分子消光系数ξ540nm(Lmmol-1Cm-1)。 (2)1.0为比色杯光径(CM)。 (3)64458为Hb分子量,64458/1000为将血红蛋白毫摩尔折算为克。 (4)251为血液稀释倍数。 由于血红蛋白不是单一品种,各种血红蛋白分子量不完全一致,所以不用IS制mmol/L表示,而报告质量浓度g/L。 [注意事项] (1)分光光度计的波长和灵敏度必须经过校准。 (2)若转化浓度浑、变绿即不可再用。 (3)转化液不能偏酸,也不能用聚乙烯瓶装,否则KCN易分解失效。 (4)丙种球蛋白或白细胞数值明显增高的血液,可出现浑浊,可按15g/L甚至50g/L加入氯化钠以防止。 (5)关于转化液中KCN毒性问题由于浓度很低仅50mg/L,故只要分散处理随时流水冲洗弃去危险性不大,但不可积存处理。 (6)若用叠氮钠、溴代十六烷三甲氨法测定血红蛋白时,均需依本法进行校准。 三、网织红细胞计数(reticulocytecount) [要求]了解网织红细胞的活体染色过程、形态学特点、计数方法并记住其参考值和临床意义。 [原理]网织红细胞是晚幼红细胞脱核后到完全成熟的红细胞之间的过程型细胞。 由于其胞质中尚残存核糖体等嗜碱性物质,故经煌焦油蓝染液活体染色后,可见有蓝绿色的点状、线状或网织红细胞结构,故名网织红细胞。 [仪器、试剂] 1.光学显微镜 2.1%煌焦油蓝生理盐水溶液 煌焦油蓝1g 枸橼酸钠0.4g 氯化钠0.85g 蒸馏水加到100ml 3.消毒、穿刺取血用具。 4.香柏油。 5.小口径试管(〈6mm内径),载玻片及推片,目镜缩小视野用纸片或米勒氏窥盘。 [方法] 1.小试管中放入1%煌焦油蓝生理盐水溶液1滴,加入病人血液1滴后混匀紧塞管口,待15min后混匀,倾出1小滴以15度角制备薄涂片。 2.干后,低倍镜下选细胞分布均匀,着色清晰处油浸镜下进行观察。 为便于计数,可与接目镜筒中放一缩小视野用的有一直径为3mm圆孔的纸片。 计数1000个红细胞,记录其中的网织红细胞数,即可得出网织红细胞的百分数值。 如1000个红细胞见到6个网织红细胞,则百分率为0.6%。 3.也可用米勒氏窥盘(Milleroculordisc)置入接目镜内进行计数(图5)。 具体方法是以窥盘的A区计数红细胞,B区计数网织红细胞,由于B区的面积为A区的9倍,故计算如下: 网织红细胞(%)=B区网织红细胞数×100%/A区红细胞数×9×100% 图5 [注意事项] 1.只有活体染色后才能看到网织红细胞,故必须将新鲜血滴与染液相混合,染液与血液之比一般约为1: 1,但若贫血严重也可按1: 2关系处理。 注意混匀,否则有时凝固。 2.染色时间不得短于10min,否则可能着色不佳。 计数前注意多部位观察,可与涂片的体尾交界处选染色好,红细胞分布既不分散又不重叠的区域进行计数。 经此种染色后红细胞呈清晰的蓝绿色,凡胞质中含有蓝绿色点状、短线状结构者为网织红细胞。 3.计数时需注意与异物或假象相区别。 如有异物残渣,多呈黑色,转动微螺旋时可见其折光性。 接目镜中粉尖重叠于红细胞上所致的假象,则随接目镜转动而移位。 勿将皱缩红细胞的较深染的皱缩点勿认为网织结构,皱缩红细胞其边缘处均匀的锯齿状可供作鉴别。 4.染色后的涂片应尽快观察计数,否则其网织结构可因久置而溶解消失,尤其在夏天湿度大的季节。 5.如拟保留涂片,需用瑞-姬氏复合染液进行复染,染色方法同白细胞分类。 复染后的红细胞呈淡红色,网织结构呈深蓝色。 6.遇再生障碍性贫血等病人,网织红细胞非常少时,可计数2000甚至5000个红细胞中的网织红细胞数或数个米勒氏窥盘面区域之后求其百分数值。 7.网织红细胞的绝对值可如下求得: ①同上法计得网织红细胞的百分率,如为3%;②同时做病人的红细胞计数,如3.0×1012/L则网织红细胞绝对值为3.0×1012/L×3%=90×109/L [参考值] 正常成人0.5-1.5% 新生儿2-6% 成人网织红细胞绝对值(24-84)×109/L 四、红细胞沉降率(erythrocytesedimentationrateESR) [要求] 了解血沉的操作技术及读取方法。 每组选一位同学在无菌操作下采取静脉血作Westergren法血沉。 记住参考值及临床意义。 [原理]血液经枸橼酸钠抗凝后,吸于特制的血沉管中,垂直竖立一小时,观察其红细胞下沉的速度,以所暴露出的血浆段的高度(mm)表示。 [仪器、试剂] 静脉穿刺用器材,包括压脉带、枕垫、无菌注射器(2ml)、2.5%碘酒,75%酒精及消毒棉签等。 特制的Westergren血沉管(全长300nm,内径2.5mm,具有0-200mm刻度)。 Westergren血沉管(图6)。 106mmol/L枸橼酸钠溶液。 [方法] 向有2ml刻度的中号试管中准确加入106mmol/L枸橼酸钠0.4ml。 作静脉穿刺后,取血约2ml,拔去针头注入上述试管内,使血量恰达2ml的化线处,轻轻混匀。 用Westergrenxue血沉管准确地吸此抗凝血至“0”刻厚处,擦净管尖,垂直竖立于血沉架上,记时。 1h后读取血浆段的高度,以mm表示。 图6魏氏血沉架和血沉管 [注意事项] 注射器内腔、血沉吸管内腔均须干燥,以防溶血。 血量与抗凝剂比例应严格遵守4: 1,并充分混匀,如有小凝块则因消耗了纤微蛋白原而使血沉减慢。 血沉吸管必须垂直竖立,如有倾斜可致血沉增快。 血沉试验应及时进行,抗凝血于室温中最长不得超过2h,否则水分蒸发,可使结果减慢。 严重贫血病人红细胞大小不均时,于1h后血浆与沉积的红细胞之间未能形成整齐的界面,此时要读取靠近较紧密沉积的红细胞层的刻度作为血沉数值。 中等度以上贫血的病人做血沉测定时,可做贫血校正试验,即将病人血用枸橼酸钠溶液按9: 1比例抗凝,以3000r/min速度离心30min之后,将上层血浆完全吸出,然后按正常人红细胞比积情况,人为的将血浆与压积红细胞按各0.50L/L的比例(男性病人)或按压积红细胞为0.40L/L,血浆为0.60L/L的比例(女性病人)混合后再作血沉测定,报告时注明系贫血校正后血沉数值。 血沉测定时室温以18-25℃为宜,温度越高血沉越快,反之减慢,但有高效价冷凝集素时则相反。 必要时需校正温度。 [参考值] 男性0-15mm/lh 女性0-20mm/lh 五、红细胞比积测定(hematocrit、HCT、PCV) [要求]了解本试验的操作方法及其参考值、临床意义。 [原理]抗凝血经一定的速度和时间离心沉淀后,得出压积的红细胞体积,后者与全血体积之比即为红细胞比积。 红细胞比积的多少,主要与红细胞数量和大小有关。 [仪器、试剂] Wintrobe分血管,此管长110nm,内径2.5mm且上下均匀一致,管壁厚、管低外圆内平、管壁两侧刻有数字;右侧最下为0最上为10;左侧最上为0最下为10,可供同时侧Wintrobe血沉及红细胞比积用(图7) 特制灌血针(针头细长可直插到Wintrobe分血管管底)或毛细滴管。 双草酸盐抗凝剂 草酸钾0.8g 草酸铵1.2g 溶于蒸馏水100ml中,分装于中号试管内,每管0.2ml,于80℃烘干后可供2ml血抗凝用。 如只用草酸钾时,每致红细胞胞体稍缩小;只用草酸铵时,可致稍膨大,两者按上述比例配合时则即可抗凝又能保持红细胞体积不变。 图7温氏分血管及毛细滴管 [方法] 取病人静脉血2ml与上述抗凝管内,轻轻振荡使抗凝剂粉末充分溶解抗凝。 充分混匀后,用特制灌血针吸血灌注于Wintrobe分血管中,使血面洽到“0”处,塞以小塞以防止蒸发。 室温中垂直静置60min后,置2264G离心力下离心沉淀30min,一般采用有效半径22.5cm的直角离心机以3000/min速度离心30min读取压积红细胞的高度,然后再以同样速度离心10min,如刻度不变时,即可按此数值计算结果。 红细胞比积=红细胞段的高度(以还原红细胞层表面为准)的mm数乘以0.01即为每升血液中红细胞体积的升数,以L/L为单位报告结果。 离心沉淀后压积管中的血液自上而下依次分为五层: ①最上层为血浆;②白色乳糜层③灰白色层为白细胞(及有核红细胞);④红细胞段最上面的红黑色薄层乃氧合血红蛋白被白细胞代谢产物还原而成的还原红细胞层⑤红黑色薄层之下为红色带氧红细胞层。 [注意事项] 为正确计算红细胞比积及红细胞的各种平均指数(如MCV、MCH、MCHC)等,应坚持用对红细胞形态无影响的双草酸盐粉剂作为抗凝剂,并应充分混合,以保证无凝块。 Wintrone分血管的内腔必须干燥洁净,以防溶血。 离心前垂直放置1h,为使红细胞与白细胞、血小板分层下沉。 离心速度和时间必须严守规程。 相对离心力(G)=0.00001118×有效半径(cm)×(每分钟转速)2。 为准确的计算MCV、MCH1、MCHC数值,必须从此抗凝血中取血作红细胞计数及血红蛋白测定,而不能从病人耳垂或指端采血。 分血管离心沉淀后红细胞的界面必须是水平的,如非水平应将界面最高与最低处的读数之和除以“2”,看结果时必须从灰白色层下的黑红色层读取数值。 通过本试验还可以得到一些其他参数: ①如血浆深黄色表示病人有黄疽②血浆乳白色表示血脂增高(乳糜微粒多),可能由于非空腹取材,也可能患有动脉粥样硬化等;③在白细胞正常的人,其灰白层仅为0.05-1mm,如白细胞增多,则可使灰白层增高,故白细胞增高患者,若不静置一小时以待分层,则对结果必将有所影响(使红细胞比积值增高)。 慢性粒细胞性白血病时,其灰白层可达数十毫米之高。 血小板显著增多的病人也有相似的影响。 [参考值] 红细胞比积(hematocrit,PCV) 成年男性0.40-0.50L/L 成年女性0.37-0.48L/L 平均红细胞体积(meancorpuscularvolume,MCV)82-82fl。 平均红细胞血红蛋白含量(meancorpuscularhemoglobin,MCH)27-31Pg。 平均红细胞血红蛋白浓度(meancorpusculauhemoglobinconcentration,MCHC)32-36%。 六白细胞计数(whitebloodcellcount) [要求]能教熟练的掌握采血技术,进一步熟悉血细胞计数板结构,能进行白细胞计数并记住参考值、临床意义。 显微镜计数法 [原理]将血液用稀释(常用2%乙酸)溶液稀释,使红细胞溶解,白细胞形态更加清晰之后,进行计数以求得每升血液内的白细胞数。 [仪器、试剂] 仪器同红细胞计数。 白细胞稀释液: 冰乙酸2ml 1%龙胆紫1ml 蒸馏水加至1000ml,过滤后备用 加龙胆紫是为了呈色,以便与其他稀释液相区别。 [方法] 1.取小试管1支,准确加入2%乙酸溶液0.33ml。 2.消毒皮肤后,穿刺取血20ul,拭净管尖外余血,迅速放入稀释液中,再用上清夜将吸管内腔洗净,混匀,待溶液转褐色后,再混匀充入计数室,待下沉2-3min后进行计数。 白细胞为无色圆形小体,于高倍镜观察可见其核。 通常于低倍镜下计数四角的四个大方格内的白细胞数按下式计算。 四个大方格内白细胞总数 4×10×20×106/L=白细胞数/L 即四个大方格内白细胞总数×0.05×109/L 上式中: 得每个大方格(即0.1ul)内白细胞平均数。 ×10为将一个大方格的容积0.1ul换算为1ul。 ×20是血液稀释倍数,即得1ul血液的白细胞数。 106将1ul血液中的白细胞数换算为1L血液中的白细胞数。 如计数4个大方格为160个白细胞,则白细胞数为1600.05×109=8×1010/L [注意事项] 1.取血及充入计数室等项与红细胞计数相同。 2.一定要在稀释液转为褐色后方能计数,否则可因红细胞残存而干扰技术,甚至错误的将红细胞计入而使结果偏高。 3.如病人白细胞过少可取2倍量的血,计数后结果除以2。 如遇白细胞过多则可按红细胞计数法,计数其中央大方格的5个中方格内白细胞数之和进行换算求得白细胞数。 4.有核红细胞在2%乙酸溶液中并不破坏,故如病人血液中有较多的有核红细胞时,对其“白细胞数值”须进行校正,方法如下: ①如常法求的白细胞数/L(实为包括幼红细胞在内的有核细胞数/L);②同时推一血涂片,用瑞-姬氏复合染液染色后进行白细胞分类,记录在分类100个白细胞的过程中所见到的有核红细胞;③按下式求白细胞数/L 校正前“有核细胞数”L为: 100 100+分类100个白细胞过程中见到有核红细胞 举例: 校正前“有核细胞数”为13×109/L,分类计数100个白细胞过程见到有核红细胞30个。 100 则: 白细胞数L=13×109/L×=10×109/L 100+30 [参考值] 成人(4.0-10.0)×109/L 初生儿(15-20)×109/L 6个月-2岁幼儿(11-12)×109/L 七白细胞分类计数(Whitecelldifferentialcount,DC) [要求] 初步掌握血涂片制作及染色技术。 学会辨认外周血中各种白细胞的形态特点及其分类计数的方法。 记住参考值和临床意义。 为观察血细胞内部结构,识别细胞种类和坚定各种异常细胞,需将血涂片染色。 最常用瑞-姬氏复合染液染色法。 [原理] Wright-Giemsa(瑞-姬氏)复合染液的染液是由酸性伊红和碱性美蓝所组成。 伊红的钠盐有色部分为阴离子,可与带正电荷的物质结合;氯化美兰有色部分为阳离子,可与带负电荷的物质结合。 二者溶解在甲醇中形成可溶性的伊红美兰溶液,即可以固定细胞有利于细胞蛋白质选择性的吸附其中有色离子而着色。 氯化美兰放置久后可氧化为天青,对细胞核染色加强,添上更多色彩,染色效果更好。 细胞的染色既有物理的吸附作用,又有化学的亲合作用。 各种细胞成分因化学性质不同,对染料的亲和力也不一样。 故可呈不同的着色特点。 例如血红蛋白、嗜酸性颗粒均为碱性物质,故与酸性染料伊红结合而染成红色。 细胞核的核蛋白与原、幼细胞的胞质为酸性物质,故与碱性染料美兰和天青相结合,染成深兰色或深紫红色。 中性颗粒与美兰和伊红同时结合而染为淡紫红色。 瑞氏染粉是由伊红化美兰组成,对胞质及中性颗粒的着色性极佳,而姬姆萨染粉由天青、伊红组成,对细胞核着色较好,结构显示更清晰。 采用瑞-姬氏复合染液可兼取两者之长、取得更好的染色效果、由于蛋白质所带电荷随溶液的PH而定,在偏酸性环境中所带正电荷增多而亲和带负电荷的的染料伊红故着色偏红。 在偏碱性环境中其负电荷增多而亲和带正电荷的美兰,而至细胞着色偏灰蓝,故为使血片每次染色效果好且趋于一致,需配制PH6.4-6.8的缓冲液,是细胞蛋白质在此恒定的环境中着色。 [仪器、试剂] 光学显微镜 瑞、姬氏复合染液瑞氏染粉0.5g,姬姆萨染粉2g,碱性美兰0.5g,混匀后加10ml甘油在乳钵内研磨,再用甲醇500ml稀释后,室温放置一周备用。 磷酸盐缓冲液(PH6.4-6.8);磷酸二氢钾0.3g,磷酸氢二钠0.2g蒸馏水加于1000ml,备用。 香柏油、二甲苯及擦镜头用纸。 光洁中性无油垢的载玻片及一端平齐稍窄于载玻片的推片,玻璃蜡笔。 [方法] 常规消毒皮肤,穿刺后拭去第一滴血。 用载波片的一端刮取血液一小滴。 将推片的平齐端置载玻片上血滴的稍前方,将推片略向后移使与血液相接触,血液遂于推片与载玻片的夹角间散开。 以约30度的夹角向前均匀的推动即可制成血涂片,其薄厚度要适中,衬以白纸时应呈淡的红黄色,且有头体尾之分。 (图8) 图8血片制备 血涂片干后,于血膜两端用玻璃蜡笔各划一线,以防染液流失,滴加瑞-姬氏复合染液数滴于血涂片上(以盖住血膜为度),静置约1min,目的在于用染液的甲醇成分固定血细胞。 加相当于染液1.5-2倍量的缓冲液充分混匀。 染色约5-10min,届时将载有染液的涂片置低倍镜下观察,若见白细胞的核着色清晰、核浆分明即可用水冲去染液,干燥后镜检。 镜检时先用低倍镜选好厚薄适宜、染色良好细胞分布均匀处,滴加香柏油一滴,用油浸镜观察。 通常计数100个白细胞(必要时可增到200或更多),按图9所示方向移动血涂片,同时将所遇到的各类白细胞分别记录、直到计数100个白细胞为止,计算每类白细胞的数目,即其百分数值。 图9白细胞分类的镜检顺序 各类白细胞的形态学: 中性粒细胞在瑞-姬氏染色血涂片上胞体成圆形,直径10-13um,胞质染粉红色,核形一叶(杆状核)至五叶不等,以三叶者多见,染为深紫红色,胞质中有许多细小紫红色颗粒。 嗜酸性粒细胞较中性粒细胞稍大,胞核多为两叶,着色较淡,胞浆内充满粗大均匀的嗜酸性颗粒,瑞-姬氏染色时呈橘红色有折光性。 嗜碱性粒细胞胞质中含有大小不等的嗜碱性颗粒,瑞-姬氏法染色是呈黑兰色。 与光学显微镜下常见胞浆中有小空泡,乃因嗜碱性颗粒易溶于水或因功能活跃而脱颗粒所致,核成淡紫红色常看不清,呈杆状亦或分叶状。 淋巴细胞胞体呈圆形,直径介于6-15um之间,分为大、中、小三型。 再成人血涂片中以小淋巴细胞多见,直径6-9um,核大成深紫色致密而浓染,胞浆量很少,若可见,呈淡兰色;大淋巴细胞直径12-15um,胞质量较多,呈清撤的淡兰色,可见少量嗜苯胺蓝颗粒,中淋巴细胞的大小及特点介于、小淋巴细胞之间。 单核细胞在瑞-姬氏染色血涂片 |
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