细胞膜色谱法用于药物与受体相互作用研究进展

侯晓芳，杜晖，贺晓双，张平，王嗣岑*

（1. 西安交通大学药学院，陕西 西安710061；2. 西安市食品药品检验所，陕西 西安710054）

·药物分析技术融合创新·

细胞膜色谱法用于药物与受体相互作用研究进展

侯晓芳1，杜晖2，贺晓双1，张平1，王嗣岑1*

（1. 西安交通大学药学院，陕西 西安710061；2. 西安市食品药品检验所，陕西 西安710054）

药物与受体相互作用研究在药物研发过程中发挥着非常重要的作用，其研究方法的便捷程度以及准确度直接影响药物研发的效率。细胞膜色谱法是贺浪冲教授于1996年提出的一种基于生物色谱的方法，用于复杂体系活性成分筛选以及药物与受体相互作用研究近20年。对细胞膜色谱法用于药物受体相互作用的研究进展进行综述。

细胞膜色谱法；受体；相互作用

受体是细胞在长期进化过程中形成的，对生物活性物质具有识别和结合能力，并具有介导细胞信号转导功能的蛋白质。多数受体存在于细胞膜上，并镶嵌在脂质双层膜结构中。受体等生物大分子与药物相互作用，直接影响药物对机体产生的生物效应和药物吸收、分布与排泄等整个代谢过程［1］。目前，研究药物与受体相互作用的方法主要有放射配基结合分析法［2］、表面等离子体共振技术［3］、拉曼光谱法［4］、紫外-可见吸收光谱法、荧光淬灭法［5］以及亲和色谱法［6］等。其中放射配基结合分析法较为成熟，但因其操作复杂，需要制备特定的放射性配基，应用受到一定程度的限制。亲和色谱法因其快速、方便、经济、无毒等优势逐渐受到青睐。一般的亲和色谱法是将纯化的受体通过化学键合的方法结合到硅胶表面，这样的制备方法存在两个问题，首先，制备一定数量及纯度的受体的难度非常大；其次化学键合的方法过于强烈，可能会影响受体的三、四级结构，从而影响受体对药物的选择性。1996年，西安交通大学贺浪冲教授提出细胞膜色谱法（cell membrane chromatography，CMC），并在全国生物医药色谱大会上首次报道了CMC法的研究成果［7］。经过20年的不断发展，CMC法已逐步成为研究药物与膜受体亲和作用的有力工具之一。

1.1 细胞膜色谱法基础方法学研究

细胞膜色谱法是以活性细胞膜为固定相的仿生亲合色谱技术，具有“识别与分离”双重特性。He等［8］以硅胶为载体，将活性细胞膜吸附在硅胶表面，用于筛选中药中的活性成分以及研究药物与受体的相互作用。电子扫描显微镜和X射线能谱显示硅胶表面已完全被细胞膜所包覆，此后，考察了硅胶载体细胞膜的酶活性

随温度、时间的变化规律和稳定性。课题组将制备好的纯硅胶固定相、兔红细胞膜和兔心肌细胞膜固定相色谱柱接入色谱系统，以一定浓度的磷酸盐缓冲液为流动相，流速设置为0.2 mL·min-1，柱温控制在37℃，对硝苯地平等钙拮抗剂在硅胶载体与硅胶载体细胞膜固定相上的色谱保留特性进行了比较。研究表明，后者对二氢吡啶类钙拮抗剂具有立体选择性；课题组进而对钙通道拮抗剂（±）-Bay-K8644进行了手性分离，发现钙拮抗剂的保留因子（k ′）与其药物活性呈正相关［9］。在此基础上，课题组研究人员分别建立了白细胞［10］、血管内皮细胞［11］、β -胰岛细胞［12］、CD40细胞［13］和血管平滑肌［14］等膜色谱固定相的制备、活性检测和表征方法。

1.2 中药复杂体系中活性成分高通量筛选

传统的活性追踪和现代的高通量筛选技术，均是以单体组分为筛选对象，提取、分离和纯化的工作量非常巨大；而CMC可直接从中药复杂体系中快速筛选发现活性组分。例如，笔者所在课题组利用血管平滑肌CMC模型分别从川芎、白芷、五味子等中药中筛选发现，川芎内酯、丁烯呋内酯、欧前胡素、五味子甲素和五味子酯甲等成分具有良好的舒张血管和抗高血压的活性［15-16］；Li等［10］和Wang等［17］利用白细胞、小鼠巨噬细胞CMC模型，分别发现了白术、苍术和鱼腥草中白术内酯Ⅰ、甲基壬基酮对小鼠腹腔巨噬细胞有抑制作用，通过抑制TNF-α、NO和H2O2产生而发挥抗炎作用。

传统的CMC方法经历了2次“更新换代”：首先，原CMC模型中分离鉴别采用离线方式完成，即通过筛选发现在特定细胞膜固定相上有保留的中药部位，采用人工方法将保留组分接收并进行下一步分离及鉴定。十几年来通过对CMC模型的改造，现已成功构建集“活性识别-色谱分离-分析鉴定”于一体的CMC-HPLC（GC）/MS在线二维分析系统；利用“双捕集环”［18］和“双富集柱”［19-20］交替富集-分析模式，将原有色谱系统成功改造为新的在线二维分析系统；并成功研制了在线阀控切换装置，真正实现了高通量筛选。其次，原CMC法中，靶细胞是通过生物组织和一般培养方法获得的，其细胞膜上的非“目标”受体的表达数量很多，而“目标”受体表达数量有限且不可控，由此建立的CMC法对配体分子识别的特异性、敏感性和选择性受到了不同程度的限制。近年来，随着生物技术的不断发展，研究者利用现代分子生物学手段，利用外源重组质粒构建了稳定高表达野生型表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）［21］、血管内皮生长因子受体（vascular epidermal growth factor receptor，VEGFR）［22］、成纤维生长因子受体-1（fibroblast growth factor receptor-1，FGFR-1）［23］等受体的人胚肾HEK293细胞株，并以相应受体选择性拮抗剂为对照样品，成功建立了受体高表达CMC模型，发现了苦参、独活、虎杖、黄芪、川乌和红毛七中选择性作用于上述受体的活性组分；分子药理学实验证明筛选得到的化合物可以抑制相应受体蛋白的表达，并具有剂量依赖性。

研究药物-受体相互作用特性通常是在体外建立相应的生物学结合模型，通过一定的分析方法获得药物作用下受体分子结构和功能的变化情况，以及药物-受体的相互作用强度、作用位点数、作用位置以及相互作用力类型等相关信息。细胞膜色谱法已被证明可以在条件温和的情况下，对小分子药物和膜受体间的亲和作用参数进行表征。

2.1 以保留因子表征药物-受体相互作用

袁秉祥课题组构建了稳定表达肾上腺素受体α1A、α1B和α1D-AR的HEK293细胞株，用于制备细胞膜色谱固定相，并研究了不同的α1-AR配体与3种受体亚型间的生物亲和作用。结果显示，9种α1-AR配体与大鼠α1A-和α1B-AR的亲和强度从大到小依次为哌唑嗪、RS-17053、5-甲基乌拉地尔、酚妥拉明、羟甲唑啉、去甲肾上腺素、BMY7378、苯肾上腺素和甲氧明；与大鼠α1D-AR的亲和强度从大到小依次为哌唑嗪、BMY7378、酚妥拉明、羟甲唑啉、5-甲基乌拉地尔、去甲肾上腺素、苯肾上腺素、甲氧明和RS-17053，这与文献报道的配体亲和顺序完全相同［24-25］。在后续的实验中，该课题组考察了流动相离子强度、样品浓度和

竞争剂浓度对亲和作用的影响；并发现应用受体高表达细胞相比于组织和原代培养细胞会大幅度增强CMC方法的灵敏度和专属性［26］。Zeng等［27］制备了豚鼠心肌细胞膜色谱模型，研究发现，（-）-普萘洛尔、（+）-普萘洛尔、美替洛尔、艾司洛尔、普拉洛尔和索他洛尔的亲和性与功能测试的配体活性呈正相关。该课题组研究人员还制备了豚鼠空肠和大鼠大脑细胞膜固定相，研究药物和毒蕈碱型乙酰胆碱受体相互作用，结果发现，一定浓度的磷酸缓冲液作为流动相时，（-）-二苯羟乙酸-3-喹咛环酯、（+）-二苯羟乙酸-3-喹咛环酯、阿托品、哌仑西平、4-二苯乙酰氧-N-甲基哌啶甲碘化物、AF-DX116、匹鲁卡品和乙酰胆碱的k ′依次减小，所得的色谱柱保留参数与文献报道的放射配体-受体结合分析测定的配体解离常数排序完全相同［26，28］。

2.2 前沿色谱分析研究药物-受体相互作用

早期研究通常用k ′来表示多种配体与相关受体亲和力的高低，但k ′不是一个常数，它与流动相中缓冲液的离子强度相关，显然使用一个变量无法对配体的亲和性做出正确的判断。平衡解离常数（KD）可以更好地反映药物与受体的结合强度，是描述亲和作用的关键参数。

前沿分析通常将被分析样品作为配体配置在流动相中，然后连续不断地通过键合受体的色谱柱，当配体与受体发生结合时，固定相逐渐饱和导致流出色谱柱的配体不断增多，从而形成一条特征性的突破曲线。突破曲线最初一部分相对平坦稳定，这代表配体与固定化受体非特异性作用，并开始发生特异性结合；而后出现拐点垂直抬高，这反映了固定相上特异性结合位点正逐渐饱和，最后结束于平台期，预示着亲和反应达到平衡。突破曲线的拐点位置与流动相中配体浓度、色谱柱上固定化受体的数目以及配体-受体的结合常数有关。Du等［29］首次利用CMC前沿分析测定了硝苯地平、尼莫地平、尼群地平、尼卡地平、氨氯地平以及维拉帕米等钙通道拮抗剂与L型钙离子通道亲和作用的平衡解离常数，分别为3.36、1.34、0.683、0.123、0.109、0.0851 μmol·L-1，6种钙通道阻滞剂的亲和强度为硝苯地平＜尼莫地平＜尼群地平＜尼卡地平＜氨氯地平＜维拉帕米，亲和强度与其在VSM/CMC模型中k′值成正比。通过竞争结合实验分析了不同类型钙通道拮抗剂的作用位点信息，推断维拉帕米与尼群地平在L型钙离子通道上的作用位点可能不同，同时尼群地平和尼卡地平、氨氯地平在相同位点有着竞争结合关系。这与文献［30-31］所报道的结果一致，即L型钙离子通道上有维拉帕米、二氢吡啶（DHP）等作用位点，两种位点分别位于离子通道内外，分别为维拉帕米和二氢吡啶类药物的结合域。通过尼群地平在25℃、31℃、43℃和49℃下的KD值，计算得出，其ΔH为-5.84 × 10-4J·mol-1，ΔS为-81.7 J·mol-1·K-1，ΔG值始终小于零，说明钙通道阻滞剂与L型钙离子通道两者是一种自发的、氢键和范德华力驱动的亲和过程。该方法还被用于研究6种配体分子氮卓斯丁、赛庚啶、多虑平、阿司咪唑、氯苯那敏及苯海拉明和组胺H1受体的亲和作用，KD值分别为87、91、99、14、22、31 μmol-1，并与放射配基方法的测定结果一致［32］。

2.3 区带流出法分析研究药物-受体相互作用

区带流出法一般是将靶点已知的配体作为竞争剂，考察样品的k ′与竞争剂浓度（C）之间的关系，它与前沿分析最大的不同是将被分析样品直接进样分析而非添加在流动相中。Beigi等［33-34］以不同浓度的纳曲酮、左吗喃、美沙酮（作用于μ阿片受体）和（R）-/（S）-普萘洛尔、布托沙明、纳多洛尔、非诺特罗（作用于β2肾上腺素受体）作为竞争剂，分别考察了［3H］-纳洛酮和［3H］-CGP-12177在两种受体固定相上的保留；另外，流动相中激动剂布托沙明和非诺特罗的加入增强了［3H］-CGP-12177在β2肾上腺素受体固定相上的保留，而且该固定相具有对映体选择性。将区带流出法应用于CMC技术，分析了α1AAR拮抗剂与α1AAR的亲和作用。通过稳定高表达α1AAR的HEK293细胞制备了色谱固定相，并利用HEK293 α1A细胞膜色谱特异性地识别可与α1AAR作用的配体，再以不同浓度的坦索罗辛为竞争剂，分别将6种拮抗剂进样分析，测得坦索罗辛、5-甲基乌拉地尔、多沙唑嗪、特拉唑嗪、阿呋唑嗪和酚妥拉明的平衡解离常数分别为1.87、2.86、3.01、3.44、3.50和7.57 μmol-1，计算结果与经典的放射配体受体结

合分析的结果呈正相关。前沿置换试验证实坦索罗辛和特拉唑嗪作用于α1AAR的同一位点，而羟甲唑啉却作用于受体的其他区域。测定结果与文献报道的放射配体受体结合分析的结果一致［35］。

2.4 非线性色谱法

非线性色谱（nonlinear chromatography，NLC）源于区带流出分析，其最大的优势是能用于配体动力学及热力学研究。NLC模型中配体的保留时间随配体浓度的增加而减小；峰型呈不对称性，拖尾程度与配体的进样浓度有关；样品峰高与浓度的变化不是线性关系［36-37］。笔者所在课题组采用非线性色谱方程拟合了埃罗替尼等3种酪氨酸激酶抑制剂的细胞膜色谱图，计算得到小分子药物在EGFR上的亲和及解离速率。同时我们利用溶质计量置换原理和细胞膜色谱技术对塔斯品碱衍生物与EGFR的亲和作用进行了解析，笔者所在课题组合成的塔斯品碱衍生物16系列在细胞膜固定相上与EGFR存在不同程度的竞争结合关系，而塔斯品碱衍生物1711和1911置换吉非替尼的能力较其他衍生物弱，即两者与EGFR的作用方式很可能与吉非替尼不同。此外，在流动相中添加脲和磷酸氢二钠，考察塔斯品碱衍生物与EGFR结合的氢键和静电力强弱，其中氢键较静电作用对其保留的影响要大一些［38］。

2.5 其他应用

笔者所在课题组应用人表皮鳞癌A431细胞膜色谱与高效液相色谱/质谱联用的方法（A431/CMC-online-LC/MS）快速筛选、分离、鉴定出中药红毛七中能作用于EGFR的活性成分——异喹啉类阿朴菲型生物碱塔斯品碱和红毛新碱。MTT实验发现，0.5～10 mg·L-1塔斯品碱对A431细胞生长呈现剂量依赖性抑制作用，其IC50为15.4 mg·L-1［39］，且塔斯品碱对A431细胞生长抑制率与其在A431/CMC上的保留时间呈正相关，计算机模拟分子对接实验显示塔斯品碱和红毛新碱作用于EGFR上不同的酪氨酸激酶活性位点，且其分子结构中的氧原子与EGFR活性位点残基间形成3个不同的氢键［19］。笔者所在课题组通过相同的方法还从传统中药苦参中筛选出具有EGFR阻断剂活性的喹诺里西啶类生物碱苦参碱和氧化苦参碱。以EGFR特异性拮抗剂吉非替尼为流动相添加剂的体外竞争-置换实验结果表明，苦参碱和氧化苦参碱在A431细胞膜表面的EGFR作用区域至少存在一类相同的亲和位点，EGF-ELISA实验和MTT实验结果显示苦参碱和氧化苦参碱均能显著抑制EGFR蛋白的分泌表达和A431细胞的生长［20］。此外，课题组还通过在线联用高表达EGFR/细胞膜色谱-高效液相色谱/质谱法（EGFR/CMC-online-LC/MS）快速筛选、鉴定出中药马钱子中具有EGFR阻断剂活性的有效成分为吲哚类生物碱马钱子碱和士的宁，体外生物学实验发现马钱子碱和士的宁能够抑制HEK293/EGFR细胞的增殖，其机制是通过抑制Erk磷酸化从而有效地抑制下游信号转导分子的表达［40］。

笔者所在课题组应用人脐静脉血管内皮细胞ECV304建立了血管内皮细胞膜色谱模型，发现塔斯品碱还可作用于VEGFR-2，而与VEGFR-1几乎无亲和作用，体外药理实验结果表明塔斯品碱能够显著抑制VEGF诱导的血管内皮细胞的管腔形成［41］。通过对比塔斯品碱在HEK293/CMC柱中和HEK293 VEGFR-2/CMC柱中的保留行为，发现塔斯品碱在HEK293 VEGFR-2/CMC柱中的保留时间为3.2 min，明显长于HEK293/CMC柱中保留时间（1.0 min）。将含有一定量塔斯品碱的流动相通入HEK293/CMC柱中和HEK293 VEGFR-2/CMC柱中发现，塔斯品碱在HEK293/CMC柱中形成的突破曲线拐点较在HEK293 VEGFR-2/CMC柱中形成的突破曲线拐点前移，说明塔斯品碱对VEGFR-2具有亲和作用。以索拉菲尼为流动相添加剂进行的直接竞争-置换实验结果表明，塔斯品碱在VEGFR-2上存在两类亲和力不同的作用位点，其与高亲和位点间的平衡解离常数KD为3.88 μmol·L-1，与低亲和位点间的平衡解离常数KD为7.04 μmol·L-1，高亲和位点和低亲和位点对塔斯品碱保留因子的贡献比例为1∶2［42］。此外，乌头中3种萜类生物碱乌头碱、新乌头碱和次乌头碱被证明在VEGFR-2上作用于同一位点，MTT实验结果显

示这3种生物碱在0.40～50.0 μmol·L-1范围内能够抑制VEGFR高表达HEK293细胞的生长，且呈显著的剂量相关性，体外VEGFR-ELISA实验结果显示乌头碱、新乌头碱、次乌头碱在0～50.0 μmol·L-1范围内呈剂量依赖性抑制VEGFR蛋白的分泌［43］。

笔者所在课题组应用构建的FGFR4/CMC-online-HPLC/MS系统从传统中药白芥子中快速筛选、鉴定出能够选择性地作用于成纤维细胞生长因子受体4（fibroblast growth factor receptor 4，FGFR4）的季铵盐类生物碱——芥子碱。MTT实验结果显示芥子碱在0.01～200.00 μmol·L-1对HEK293-pcDNA细胞生长的抑制活性显著高于对HEK293-FGFR4细胞生长的抑制活性，说明FGFR4的存在与耐药性的形成有关。直接竞争-置换实验显示，随着流动相添加剂吉非替尼浓度的增加，芥子碱在FGFR-4上的k ′呈递减趋势，说明芥子碱和吉非替尼在FGFR4上存在相同的作用位点，与该作用位点间的平衡解离常数分别为17.00和 5.75 μmol·L-1，通过分子对接模拟实验从另一个方面证明芥子碱和吉非替尼均作用于FGFR4上的酪氨酸激酶位点［44］。

药物-受体的亲和作用直接影响药物的代谢过程及药效学，细胞膜色谱作为一种全新的生物亲和色谱，实现了高效液相色谱分离和受体药理学的有机结合。但这个过程往往不是几种简单理想的模型能够准确描述，所以如何避免测定中的干扰、增强方法的专属性是今后研究的重点所在。此外，细胞膜色谱有其特殊性，载体表面的细胞膜活性随时间不断衰减，因此如何将亲和色谱理论应用到细胞膜色谱法中，在较短的时间内观察配体在细胞膜固定相上的保留特征，建立快速表征药物-受体亲和作用的研究方法，也是一个非常重要的研究课题。

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［专家介绍］ 王嗣岑：1974年生，陕西兴平人，医学博士。现为西安交通大学医学部药物分析教授、博士研究生导师、药学院副院长、药物研究所党支部书记/副所长。主要从事细胞膜色谱新方法、中药活性成分筛选及中药物质基础分析等研究。发表SCI论文70余篇，他引300余次，H因子为12，其中以通讯/第一作者在本学科国际著名期刊J Chromatogr A、Food Chem、J Pharm Biomed Anal、J Chromatogr B、Anal Method等发表SCI论文36篇。参与申请国家发明专利23项（4项为第一发明人）及国际发明专利2项，其中授权国家发明专利12项。获国家技术发明奖二等奖1项（第二完成人）、陕西省科学技术奖励一等奖2项（第三完成人）及陕西省青年科技奖。

Advances in Research on the Application of Cell Membrane Chromatography in the Study of Drug-Receptor Interactions

HOU Xiaofang1， DU Hui2， HE Xiaoshuang1， ZHANG Ping1，WANG Sicen1（1. School of Pharmacy， Xi’an Jiaotong University， Xi’an 710061， China； 2. Xi’an Institute for Food and Drug Control， Xi’an 710054， China）

Investigations on drug-receptor interactions are crucial for drug development process. The convenience and accuracy of research methodology directly affect the efficiency of drug development. As a new bio-chromatography method proposed by Prof. Langchong He in 1996， cell membrane chromatography has been applied to screen active components from complex system and study the drug-receptor interactions for almost 20 years. In this paper， the research progress in the application of cell membrane chromatography in the study of drug-receptor interactions was reviewed.

cell membrane chromatography； receptor； interaction

O657.7

A

1001-5094（2015）12-0882-07

接受日期：2015-11-10

项目资助：国家科技部重大新药创制专项课题（2012ZX09103201-054）；国家自然科学基金项目（No.81102414）

*通讯作者：王嗣岑，教授，博士生导师；

研究方向：中药物质基础分析，生物色谱分析；

Tel：029-82656788；E-mail: [email protected]

药学进展2015年12期