|
细胞中总RNA的提取
（1）80~90%汇合的生长状态良好的贴壁细胞弃培养基后按3ml/10cm 直径培养皿贴壁细胞加入Trizol，反复吹打至液体完全透明，室温放置5min。
（2）按200ul氯仿/ ml Trizol的量加入氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min。注：剧烈震荡使基因组DNA断裂。
（3）4℃离心，12000rpm，15min。注：离心后分为三层，下层为红色的苯酚—氯仿层，中间层和上层的水样层，RNA存在于水样层中。若只提RNA，千万不要吸取中间层和下层酚—酚相，可保存于4℃冰箱。
（4）将上层水相转移至另一个EP管中，加入等体积的异丙醇并混匀(约500ul)，室温放置10min。
（5）4℃离心，12000 rpm，10min，用枪头小心吸走液体，RNA沉于管底。
（6）用1ml 75%乙醇（DEPC水，现用现配）洗涤RNA沉淀，温和振荡离心管，悬浮沉淀。（7）4℃离心，8,000rpm，5min。弃去乙醇后，室温干燥RNA沉淀5-10min。 注： RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。
（8）可用50ul H2O（根据RNA量，可以适当调整），TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60℃ 溶解5-10min，保存于-20℃（最好-80℃）。注：H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。
2．RNA的琼脂糖凝胶电泳
1）用1×TBE电泳缓冲液制作1.5%琼脂糖凝胶，加1×TBE电泳缓冲液覆盖凝胶。
2）取RNA样品3μl于封口膜上及2μl 的6×加样缓冲液，混匀后，用微量移液器小心加入点样孔。
3）打开电源开关，调节电压至110V，使RNA由负极向正极电泳，约20min后将凝胶放在凝胶成像仪上观察RNA电泳结果。
四、 注意事项：
1．所用耗材均为去RNA酶材料；
2．注意带口罩和手套，避免RNA降解；
3．加样准确。
image.png
image.png
image.png
image.png
|