药物研究专题 (一)：DSF和SPR技术用于药物靶标验证

相对于单一靶点的传统方法难以适应多靶点、复杂药物机制的研究，高通量筛选技术具有微量、快速、灵敏和准确等特点，使得筛选药物靶点的效率和准确性提高。NanoDSF 可用于监测生物制剂配方、可开发性、生产和制造过程中的热稳定性；亲和筛选前评估靶标配体复合物；优化结构生物学结晶条件。为筛选药物潜在靶点蛋白，药物小分子作用机理、临床药理学等方面的研究提供解决方案。而 SPR 技术作为分子互作检测的金标准，Biacore 一直是药物研发与申报中必不可少的工具，已经广泛应用于抗体、重组蛋白、疫苗、小分子化合物等的研发与生产、药靶验证等各个方面。

无标记 DSF (NanoDSF) 则是基于蛋白去折叠过程中色氨酸发射光谱的位移进行检测。因此，通过检测荧光变化，可实现在非标记环境下评估蛋白质热稳定性、化学稳定性、胶体稳定性、变复性能力等性质。

SPR 表面等离子共振技术的光源为偏振光，传感芯片表面镀有一层金膜，实验时，先将一种生物分子 (靶分子) 固定在金膜表面，然后将与之相互作用的分子溶于溶液 (或混合液) 流过芯片表面。在金膜芯片上的蛋白和流路中的分子结合有解离的过程中，共振角 (即SPR角) 就会随之发生变化，检测器检测到这种变化，根据此变化曲线作图分析，可得出分子间的结合常数Ka、解离常数Kd或亲和力常数KD。

铁死亡是一种新型的程序性细胞死亡，其特点是过度的铁依赖性脂质过氧化。抑制铁死亡被认为是治疗多种疾病的一种有前途的策略。目前，大多数已知的铁死亡抑制剂属于抗氧化剂或铁螯合剂。在此，研究人员报告了一种新的铁死亡抑制剂，称为 YL-939，它既不是抗氧化剂，也不是铁螯合剂。化学蛋白质组学揭示 YL-939 的生物学靶点是抑制素2 (PHB2)，并通过各种分子生物学实验进一步证实，YL-939 与PHB2 结合可促进铁储存蛋白铁蛋白的表达，从而降低铁含量，从而降低铁死亡的易感性。作者进一步表明 YL-939 通过靶向 PHB2/铁蛋白/铁轴，可以显著改善铁死亡相关的急性肝损伤模型中的肝损伤[1]。

研究人员首先通过约 4000 种化合物的内部化学库筛选到了一种非经典铁死亡抑制剂 Cpd-015，随后通过结构优化过程制备了 7 种新化合物并筛选到活性最强的化合物 YL-939。为了快速确定 YL-939 的生物学靶点，研究人员首先使用 Eurofins 提供的激酶分析方法测试了 YL-939 对 401 种重组人蛋白激酶的活性。因为 YL-939 在该测定中表现出非常弱的活性或没有活性，这意味着 YL-939 不与这些激酶结合。

接着通过 ABPP 策略筛选到 YL-939 可能的 3 个靶点，作者后续在大肠杆菌表达系统中表达并纯化了 PHB2 (1-194) 蛋白，采用 SPR 技术检测 YL-939 和 PHB2 蛋白亲和力，结果表明，YL-939 和 PHB2 蛋白能较好的结合，且亲和力大小为 3.43±1.8 μM (图 3A)，而 YL-939 结构相似的化合物 YL-447 在浓度为 10 μM的铁死亡抑制试验中没有活性，用作阴性对照 (图 3B)。而差示扫描荧光法 (DSF) 分析结果表明：YL-939 和 PHB2 的热位移  (ΔTm) 为2.65°C，而阴性对照 YL-447 在 SPR 和 DSF 测定中均未显示出与 PHB2 的结合活性。

接下来研究探讨了 YL-939 和 PHB2 之间可能的结合模式。研究采用分子对接预测 YL-939 的结合位点，由于缺乏 PHB2 结构信息，AlphaFold 预测的 PHB2 的三维结构作为受体结构。对接结果表明，YL-939 与 PHB2 形成两个氢键：一个在吡唑环的氮原子和残基 D82 之间，另一个在哌啶环的氮原子和残基 D127 之间 (图 3C)。为了验证预测的结合模式，研究合成了 PHB2 的两个突变体 D82A 和 D127A，并通过 DSF 重新测试了 YL-939 的结合能力。结果表明，这两个突变体几乎消除了 YL-939 与 PHB2 的结合 (图 3D)。此外，与 PHB2-WT 相比，D82A 和 D127A 突变体降低了铁死亡对 erastin 的敏感性 (图 3E、3F)。

Method: Differential scanning fluorimetry assay (DSF)

DSF experiments were performed using Bio-Rad CFX ConnectTM Real-Time System. First, 9.8 μL protein and SYPRO Orange mixture were added per well, and then mixed 0.2 μL compound. The final assay volume is 10 μL. The final assay system contained 20 mM Hepes, pH 7.5 150 mm NaCl, 10 μM protein, and 200 μM compound. Thermal denaturation was achieved by a temperature ramp from 25 °C to 95 °C (1 °C per minute).

Surface plasmon resonance (SPR)

PHB21–194 was immobilized to 6000–9000 response units on flow cells 3 and 4 of Biacore series S CM5 sensor chip (GE Healthcare) on a Biacore S200 instrument (GE Healthcare) after predilution to HBS buffer (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% w/v Surfactant P20, pH7.4). After changing to assay buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 0.05% w/v Surfactant P20, pH 7.2–7.4), the sensor chip was predilution before used for Kd measurements. The flow rate was 10 μL min−1, and the contact time and dissociation time were 120 s and 100 s, respectively. Data reported in this study are means of at least two independent experiments ± standard deviations.

缺血性中风仍然是全球死亡的主要原因之一，因此迫切需要寻找新的治疗靶点。DOHH 是催化真核翻译起始因子 5A (eIF5A) 独特的翻译后超修饰的一种基本酶，高度参与了多种人类疾病的进展包括 HIV-1 感染、癌症、疟疾和糖尿病。然而，DOHH 的药理调控在缺血性中风中的潜在治疗作用仍鲜为人知。作者研究首次发现了一种天然的小分子化合物巴西苷  (BZ) ，它对脑缺血/再灌注 (I/R) 损伤具有明显的神经保护作用。然后，研究人员通过使用 HuProt™ 人类蛋白质组芯片技术全局性、系统性地筛选出了 BZ 的直接互作靶蛋白 DOHH，并且 Cys232 被证明是 DOHH与 BZ 结合的关键位点。BZ 直接与 DOHH 互作并调控其活性来增强体内 eIF5A hypusine 翻译后修饰，促进线粒体自噬，从而发挥有效的脑保护作用。研究人员首次发现 DOHH 是一种以前未报道过的治疗缺血性中风的靶点，BZ 可作为潜在治疗药物，为缺血性中风的靶向治疗提供新的研究方向[2]。

Pull down 实验表明：BZ 与细胞内过表达的 DOHH 和重组的 DOHH 都有结合，过量的 BZ 会以浓度依赖的方式竞争性地抑制这种结合  (图 4A)，这表明 BZ 与 DOHH 有直接的特异性相互作用。为了验证这个结论，研究团队分别开展了动力学和热力学实验。动力学实验包括表面等离子体共振 (SPR) 、生物层干涉术  (BLI) 测定。热力学实验包括等温滴定量热法  (ITC) 实验、微量差示扫描荧光法  (nanoDSF)。表面等离子体共振 (SPR) 和生物层干涉技术 (BLI) 分别证明了 BZ 与 DOHH 的结合力很强，亲和值 (KD) 分别为 1.4 μM和 5.8 μM (图 4B和 4C)。在热力学等温滴定量热法 (ITC) 实验表明，BZ 和 DOHH 之间有很强的相互作用，KD 为 2.9 μM (图 4D)，微量差示扫描荧光测定法 (nanoDSF) 实验表明，BZ 增加了 DOHH 的热稳定性 (图 4E)。细胞热迁移技术 (CETSA) 也显示，与对照组相比，BZ 增加了 DOHH 的热稳定性 (图 4F)。此外，药物亲和反应靶点稳定技术 (drug affinity responsive target stability, DARTS) 检测表明，BZ 可减少蛋白水解 (图 4G)，这证实了 BZ 与 DOHH 的相互作用。综上结果：DOHH 是 BZ 的直接细胞靶蛋白。

研究人员发现代表着向开发具有神经保护作用的 DOHH 小分子异位激活剂迈出了关键的第一步。该研究还证明 DOHH 在神经细胞存活的关键作用，并强调了靶向 DOHH 在防治缺血性中风具备广泛潜力。通过靶向治疗中风引起的神经元损伤，可以改善相关症状，为有效治疗缺血性中风提供了新思路。

[1] Yang, Wei, et al. "Non-classical ferroptosis inhibition by a small molecule targeting PHB2." Nature Communications 13.1 (2022): 7473.

[2] Guo, Qiang, et al. "Deoxyhypusine hydroxylase as a novel pharmacological target for ischemic stroke via inducing a unique post-translational hypusination modification." Pharmacological Research 176 (2022): 106046.

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