通过在低细胞浓度下启动甲醇诱导、优化碳/能量代谢模式促进毕赤酵母表达Monellin

Monellin 是西非植物 Dioscoreophyllum cumminsii 浆果中的一种天然甜味蛋白，它的甜度是相同质量蔗糖的3 000倍[1]。与其他的甜蛋白(如pentadin，thaumatin等)相类似，monellin也是一种非碳水化合物甜味剂，对于那些患有严重糖尿病但却嗜好传统糖类食品的人群而言是一种健康食品[2]。Monellin可以制作成安慰甜味剂或甜酵母片供糖尿病人食用[3-4]。Monellin纯品价格昂贵，Sigma公司销售的纯度为95%的monellin价格为$100/100 mg (http://www.zhenghe.cn/JiShuTong/CG_TechnologyInfo_T.aspx?key=24ccc46229984a019028ee1a95034ac3)。Monellin也能够通过微生物的生化反应方法合成。在最新报道中，Chen等利用含有 sacB 启动子和信号肽的枯草芽孢杆菌生产monellin，monellin最大浓度达到0.29 g/L[5]。Liu等在重组酿酒酵母中表达monellin，monellin的最高浓度为0.675 g/L[6]。Leone等利用重组大肠杆菌表达monellin，其浓度大约为0.18 g/L[7]。

甲醇营养型毕赤酵母被认为是一种高效的外源蛋白表达系统[8]，该系统具有分子遗传操作方便、细胞易于达到高密度、外源蛋白的表达水平相对较高的特性。重组毕赤酵母表达外源蛋白的过程主要分为两个阶段：生长阶段，以甘油为碳源、获取大量的功能性细胞；诱导阶段，通过流加甲醇来诱导表达重组蛋白[9]。通常情况下，当细胞达到高密度(100−130 g DCW/L)时，将碳源从甘油切换成甲醇，并将甲醇浓度维持在适宜水平开始诱导[10-11]。然而，这种“标准”型外源蛋白表达策略有以下缺点：1)高耗氧特性，通空气供氧、培养后期/诱导期的溶氧浓度(DO)无法控制；2)如果追求高细胞浓度，在细胞培养后期乙醇会积累，导致外源蛋白生产表达的不稳定[12]；3)在较低温度(20 ℃)下诱导有利于外源蛋白的表达，可以增强AOX的活性，缓解目标蛋白的降解，但是低温诱导会增加热交换压力与氧气供应的负担/成本[13]，特别是在夏季；4)能量(NADH)物质的无效生成可造成过多/无效的甲醇消耗，降低整个发酵性能[9, 14]。为了解决上述问题，人们提出了另一种在低细胞浓度下启动甲醇诱导的操作策略。Wang等使用该策略表达碱性果胶酶，发现在低细胞浓度56.7 g DCW/L下启动甲醇诱导，蛋白生产效率(Qv)最大，比在细胞浓度83.39或124.9 g DCW/L启动诱导的Qv高11.6%和18.4%[15]。Jia等报道指出，在低细胞浓度60 g DCW/L时启动诱导，同时将诱导温度控制在22 ℃的较低水平，提高了聚(乙烯醇)脱氢酶的产量，且DO一直处于可控范围(5%–20%)内[16]。然而，在低/高细胞浓度下启动甲醇诱导时，甲醇/能量变化模式的相关报道很少，诱导性能得到优化的机制/机理尚不明确。

文中分析了在不同细胞浓度(50、100 g DCW/L)及其不同的诱导温度(20、30 ℃)下，毕赤酵母表达monellin的甲醇/能量代谢模式，试图解释在较低细胞浓度下启动诱导的控制策略可以促进monellin表达的原因，为毕赤酵母表达外源蛋白的过程控制提供一些有用信息。

甲醇利用慢型重组毕赤酵母 Pichia pastoris KM71菌株由武汉轻工业大学构建并提供。表达载体为pPICZαA，重组质粒为pPICZαA-Mon。

培养基(g/L)的组成如下所示：YPD培养基(葡萄糖20，酵母提取物10，蛋白胨20)用于种子培养。分批发酵培养基：甘油20，(NH4)2SO4 5，H3PO4 2 (%，V/V)，MgSO4 1，CaSO4 0.1，K2SO4 1；PTM1 10 (mL/L)，pH 6.0。生长流加培养基：甘油500，(NH4)2SO4 0.5，KH2PO4 0. 5，MgSO4 0.03；PTM1 10 (mL/L)，pH 6.0。诱导流加培养基：纯甲醇；PTM1 10 (mL/L)，pH 6.0。

毕赤酵母分批培养在5 L发酵罐(百仑生物科技有限公司，BLBIO-5GJ-3-H)中进行，由1个显示屏/控制柜同时驱动2个5 L发酵罐。初始装液量为2.0 L。接种量和通气量分别为14% (V/V)和3 vvm。在细胞生长期，手动提高搅拌转速至700 r/min将DO维持在10%以上。采用标准或改进型DO-Stat[12]策略进行甘油流加，实现细胞高密度培养。如果最大搅拌转速下，DO基线仍不能维持在10%以上，则需要通入纯氧。用5% (V/V)的氨水将pH维持在6.0。甘油/乙醇(副产物)完全耗尽后，开始流加纯甲醇，进入诱导期，并根据需要将诱导温度控制在30 ℃或20 ℃，pH维持不变。使用配有多通道A/D-D/A转换器(台湾研华科技有限公司，PCL-812PG)的工控机，根据甲醇(上海苏泊公司，FC-2002)和DO电极在线测量结果驱动蠕动泵(河北保定兰格有限公司，BT00-50M)进行甲醇/甘油流加。在诱导期，采用甲醇ON-OFF控制策略将甲醇浓度控制在5–7 g/L的范围。甲醇电极也能够在线测量生长期的乙醇浓度并且与DO测量[12]相结合来调节甘油流加速率。利用尾气分析仪(韩国Lokas公司，LKM2000A)在线检测尾气(通入空气)中O2和CO2分压。O2消耗速率(OUR)和CO2释放速率(CER)可通过标准计算公式[17]确定。

细胞浓度通过测量波长600 nm (OD600)处的吸光值测定，根据细胞干重(DCW/L)与OD600值的线性关系曲线(DCW/L=0.25×OD600)计算DCW/L。甲醇和乙醇浓度通过气相色谱仪(上海精密科学仪器有限公司，GC112A，FID检测器；Alpha-Col AC20毛细管柱，澳大利亚SGE国际有限公司)进行测定。中间代谢产物甲醛和甲酸的浓度通过高效液相色谱仪(反向ZORBAX SB C18柱，254 nm，紫外检测器)进行测定。流动相是20 mmol/L的Na2PO4溶液(99%)和乙腈(1%)。进样量10 μL，柱温为28 ℃。电泳板的Marker泳道加入20 μL分子量已知的蛋白溶液。聚丙烯酰胺凝胶电泳(12%分离胶)以标准分子量作为基准直至溴酚蓝达到分离胶的底部。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析后，通过G:Box生物成像系统和基因工具软件(英国SynGene公司)对发酵moenllin的浓度进行定量。每个条带扫描三次取平均值作为定量结果。此外，以10 g/L的蔗糖溶液为对照，对无细胞发酵上清液进行甜味检测。电子天平(上海海康电子仪器厂，JA1102)通过RS232通信接口与工控机连接，通过测量甲醇流加瓶的重量减少量在线检测甲醇消耗量(g/L)。细胞浓度(X)、甲醇消耗量(S)和monellin浓度(P)分别与独立变量(诱导)时间进行二次多项式拟合，以浓度对时间t进行微分(dX/dt，dS/dt，dP/dt)，确定细胞生长/甲醇消耗/monellin合成的比速率。

如图 1所示，碳(甲醇)代谢用于4个不同部分：细胞生长、维持代谢、monellin合成和供能。其中，根据经典生物工程教科书[18-20]，用于细胞生长和维持代谢的碳流比率可由式1确定。

式中的ν、μ、YX/S和m分别表示甲醇比消耗速率、细胞比生长速率、细胞对甲醇的得率系数和维持代谢常数。

这里，X和S分别表示细胞和底物浓度；F是甲醇流加速率，由甲醇浓度自动控制系统确定；V是发酵液体积；SF是甲醇流加浓度；k和k-1分别代表当前取样时刻和上一个取样时刻；ΔT是取样间隔；X(k/k-1)是取样间隔内细胞的平均浓度。由于甲醇浓度基本控制在5 g/L左右的低水平(dS/dt≈0)，且使用纯甲醇流加，SF–S≈SF，SF就是甲醇的密度(800 g/L)。由于直接添加100%的纯甲醇，添加量较少，且逃液量有限。通过适度调控采样频率和体积可以将发酵液体积V控制恒定水平。以μ和ν为横纵坐标，对不同诱导条件下的ν和μ数据作图，从直线的斜率可以得到用于细胞生长对底物的得率(YX/S)。再根据文献报道[15, 21]，毕赤酵母细胞中的碳含量在50%左右，因此，将原有的YX/S乘50%进行计算，可得到真正用于细胞生长的碳流(甲醇消耗)比率。在计算细胞维持代谢能(mXE)方面，仍沿用公式1来进行计算，但通过对该公式变形来计算真正意义上的细胞维持代谢能(mXE)：

式3是公式1的转化版，即细胞对底物得率(YX/S)必须要扣除用于细胞维持代谢能(mXE)的碳流比例。但是，由于诱导过程中1/v和μ/v均在变化，因此，mXE不再是一个数值而是处在一定范围内。因此，我们利用下式计算mXE的平均值，得到用于维持代谢能的碳流比例。

式中，mXE(t)、ΔT、T分别是特定时刻计算得到的细胞维持代谢能(碳流比率)、采样和计算间隔、以及总诱导时间。另一方面，如图 1所示，一部分甲醇必须通过异化产能(供能)途径A合成能量物质(NADH)，同时释放出CO2。供能途径中总的甲醇消耗/代谢比率(ε)、包括用于monellin合成εP和细胞维持代谢m的供能比例，可由式5计算得到。

式中的CER，tf和AMeOHT分别表示CO2释放速率、总诱导时间和甲醇总消耗量。最后，用于monellin合成(前体)的甲醇消耗比率(γ)可由式6确定。

在5 L发酵罐中共进行了4批发酵实验。批次#1–2中，细胞达到高密度(100 g DCW/L左右)后开始诱导。在批次#3–4中，当细胞浓度在低密度(50 g DCW/L左右)时开始诱导。批次#3–4中，通空气，采用传统DO-Stat控制策略进行甘油流加。但是，当细胞浓度达到50−60 g DCW/L以后，DO下线(基线)降低到接近于0的水平，导致细胞生长停止，细胞比生长速率接近于0。因此，在批次#3中，当细胞停止生长后，立即启动甲醇诱导，进入诱导期。而在批次#1中，当细胞浓度达到50 g DCW/L左右、细胞停止生长后，将供氧模式从通空气改为通纯氧，以确保DO基线高于某临界值(约5%)。如图 2所示，通入纯氧后，DO平均水平升高，细胞生长恢复，但乙醇也开始积累。有报道指出[12]，乙醇的历史积累严重破坏重组毕赤酵母的功能骨架，严重影响外源蛋白的表达和发酵稳定性。因此，本研究中采用改良型DO-Stat[12]策略，将乙醇浓度控制在低水平(2 g/L以下)。如图 2所示，发酵批次#1中，当细胞浓度达到50−60 g DCW/L后，通纯氧并采用改良型DO-Stat策略流加甘油，细胞最终可以达到高密度(100 g DCW/L)，且最大乙醇浓度低于2.1 g/L。因此，理论上批次#1可以实现monellin的高效表达。

具体的诱导操作策略如下：批次#1−2在高细胞浓度(100 g DCW/L)下启动甲醇诱导，诱导温度分别是30 ℃ (批次#1)和20 ℃ (批次#2)；批次#3−4在低细胞浓度(50 g DCW/L)下开始诱导，并将诱导温度控制在30 ℃ (批次#3)和20 ℃ (批次#4)。批次#3中，monellin浓度达到了2.62 g/L的最高水平；其次是批次#4，monellin浓度为1.87 g/L (图 3C)。但是，当采用标准诱导策略(高细胞浓度下启动诱导)时，monellin浓度分别为1.04 g/L (批次#2，20 ℃)和0.54 g/L (批次#1，30 ℃)，发酵性能很差。上述结果也总结归纳于表 1中。此外，收集无细胞发酵上清液检测其甜度。双盲测试结果表明，批次#3中收集得到的上清液甜度明显高于其他批次中的上清液甜度。图 3B和3D是批次#1−4中monellin浓度随时间变化的SDS-PAGE图，Monellin分子量为10.7 kDa。批次#3−4中，monellin表达量随诱导时间逐渐增加，而批次#1−2中的monellin浓度基本不变。此外，无论胞内还是胞外，甲醇代谢的中间毒副产物甲醛和甲酸均未检测到(数据未显示)。

如图 1所示，碳(甲醇)代谢用于4个不同部分：细胞生长、维持代谢、monellin合成和供能。碳流分配比率可由公式1−6确定。另外，我们假定monellin比合成速率(ρ)和细胞比生长速率(μ)遵从Luedeking-Piret模型，即

Luedeking-Piret模型是关联目标代谢产物比合成速度与细胞比生长速度之间关系的、比较公认的基础模型。因此，碳代谢和monellin合成模式可由式1−7确定。

一般认为，乙醇、乳酸等初级代谢产物发酵生产属于代谢产物合成/细胞生长完全耦联型，氨基酸、某些有机酸等发酵生产属于代谢产物合成/细胞生长半耦联型，而抗生素等次级代谢产物的发酵生产则属于代谢产物合成/细胞生长非耦联型。

图 4是不同诱导策略下的μ、v和ρ的变化模式。其中，图 4B和图 4C也间接显示了二级发酵参数YX/S、α和β的差异。表 2则总结归纳了不同诱导策略(批次)下主要二级发酵参数YX/S、mXE、εP、γ、α和β的差异和变化。

上述结果表明，采用低细胞浓度下启动诱导的策略，1)细胞比生长速率高但用于细胞生长的碳流较少(图 4B中，斜率1/YX/S较大)。2) 30 ℃下monellin的比合成速率与细胞比生长速率完全耦联、耦联系数(α)最大，且细胞比生长速率μ也较高(第二大)，这可能是批次#3中monellin浓度达到最大的一个原因。3)甲醇供能途径A中用于能量NADH合成的甲醇消耗比率εP较大(用于为monellin合成供能)。低细胞浓度下诱导，εP=22.7%−29.2%；高细胞浓度下诱导，εP=14.0%−19.0%，整个代谢过程中的细胞/monellin合成有足够的能量支撑。4) 30 ℃下用于monellin前体合成的甲醇利用比率γ最大(65.2%)，而且与较高的能量支撑相匹配。此时，应该有较多的前体物质(氨基酸等)[22]可用于甜味蛋白monellin合成。

需要说明的是，在批次#1中，由于诱导表达后产生的monellin立即降解(图 3A)，数据不符合Luedeking-Piret模型，因此相应参数未在图 4和表 2中显示。

能量利用效率是增强毕赤酵母表达monellin的另一个重要因素。碳代谢和能量代谢必须相匹配才能提高发酵性能。如表 2所示，批次#1和批次#3中走向前体物质合成途径的碳流比率相差较大(γ=48%，批次#1；γ=65%，批次#3)，走向能量代谢(用于monellin合成)的碳流比率相差也很大(批次#1，εP=14%；批次#3，εP=23%)。因此，批次#3中的甲醇/能量代谢比例是比较匹配的。另外，能量利用效率在毕赤酵母代谢甲醇的过程中是非常重要的。该效率取决于氧化磷酸化反应中的氧气消耗速率，并直接影响到用于细胞生长/ monellin合成的能量供给-ATP再生速率。如图 1所示，在甲醇代谢过程中有两个耗氧步骤。第一步是甲醇经AOX酶的催化生成甲醛(HCHO)，这是甲醇代谢的中枢和第一个代谢反应。这个步骤中O2消耗速率(rO2(1))由式9确定。

这里T和t分别表示温度和诱导时间。第二步耗氧反应发生在氧化磷酸化反应过程中，该过程将供能途径A中生成的NADH转化为ATP，此步骤中的O2消耗速率rO2(2)可由甲醇消耗速率rMeOH和OUR并结合公式11计算得到。

式中的rMeOH、rNADHF、rNADHC、rATP、OUR和CER分别表示甲醇消耗速率、NADH合成速率、NADH利用速率、氧化磷酸化反应中的ATP再生速率、O2消耗速率和CO2释放速率。

理论上ATP再生速率rATP取决于公式14中的rO2(2)或rNADHC。假设不同诱导温度下P/O比例恒定不变，ATP再生速率rATP可由rATP=(P/O) rNADHC表示。这里，我们定义一个新参数η来表示能量利用效率。

即η (rNADHC/ rNADHF)定义为毕赤酵母表达外源蛋白时的能量利用效率。理论上，η=1表明氧化磷酸化过程可以将所有来源于甲醇异化产能途径的NADH完全氧化，再生ATP，为外源蛋白合成/细胞生长-维持代谢提供能量。如图 1所示，如果η > 1，表明NADH的需求量高于其生成量，这意味着NADH的需求量是受限的，最大NADH需求量rNADHC只能等于其生成量rNADHF。针对η的取值，我们进行如下聚类：如果η≥1，途径A中生成的NADH可完全(100%)用于ATP的再生，为monellin合成/细胞生长-维持代谢提供能量；如果0.8 < η < 1.0，能量利用效率被认为处于较高水平；如果η≤0.8，表明能量利用效率处于低水平，产生的NADH不能有效地用于ATP再生为monellin合成/细胞生长-维持代谢提供能量。图 5A和表 2是批次#1–4中整个诱导阶段每小时间隔内的η聚类结果。如该图和表所示，批次#3 (低细胞浓度诱导，诱导温度30 ℃)中高η (η≥1，非常高；0.8 < η < 1.0，较高)的聚类比例是最高的(η≥1，49%；0.8 < η < 1.0，40%；共89%)。批次#1 (较高细胞浓度启动甲醇诱导，诱导温度30 ℃)中低η (η≤0.8，100%；0.8 < η < 1.0和η≥1.0，0%)聚类比例是100%。批次#2和批次#4中高η (0.8 < η < 1.0+η≥1.0)的聚类比例分别是34%和63%，介于批次#1和批次#3之间。图 5B是两个极端批次(批次#1和批次#3)中η随时间的变化情况。

如图 3和表 1所示，批次#1中表达monellin浓度最低，且诱导表达后立即降解。原因可能有两个：1)批次#1中，用于供能/蛋白合成的甲醇利用比例(εP/γ)较低，εP/γ=0.29，供能/蛋白合成的碳流比率低；而批次#3的εP/γ较高，εP/γ=0.35，供能/蛋白合成的碳流比率相对匹配。2)批次#1中的NADH利用效率η低于0.8 (η≤0.8)的比例为100%，极低的能量效率是导致最低monellin浓度的另一个重要原因。相反，批次#3中、η数据的绝大多数(89%)都高于0.8 (η≥0.8)，表明途径A中产生的NADH能高效地用于ATP再生以支撑monellin合成。综合这两个因素，发酵批次#3的monellin浓度达到2.62 g/L的最高水平。

需要指出的是，η > 1是不符合实际的(η=1是理论上的最大值)。不符实际数据(η > 1)的产生源于OUR、CER和甲醇消耗速率的在线测量。因为这些在线测量系统是独立的，同时在实际操作过程中OUR和CER对于尾气分析仪干燥剂(硅胶)的频繁更换非常敏感。另外，计量甲醇添加量的电子天平的零点漂移较大，每10 h “负漂移”在10−20 g左右。由于低细胞密度诱导条件下，甲醇添加速度较慢，monellin能持续表达，诱导时间长，根据公式11、13和15，该“负漂移”实际上间接加大了η计算公式的分子且贡献较大，导致η > 1数据的频繁出现。相反，在高细胞密度下启动甲醇诱导，甲醇添加速度相对快。这时，零点漂移虽然也加大了η计算公式的分子，但贡献率相对较低。同时，该条件下，能量利用效率参数η也确实低，所以在观察窗口内η > 1的数据一个都没有出现。总之，大多数η > 1的数据均处于1.00-1.25，稍高于1的区域内。考虑到大多数发酵过程中严重的测量噪声，因此，上述数据还是可以接受的。虽然批次#3中有许多η的数据大于1，但是批次#1中所有η的数据均未超过0.8。这些数据至少可以解释这两个极端批次(#1和#3)中NADH利用效率与monellin浓度的关联性。

最后，必须承认目标蛋白(monellin)对甲醇的得率YP/S低下，仅有0.11%-0.75% (表 1)。其中，批次#3的得率最高，达到0.75%。这与许多文献中目标蛋白/抗体对甲醇的得率低是相一致的(0.020%-0.093%)[12, 23-26]。目标产物产量与甲醇消耗量比例(得率)很低，但并不意味着走向目标蛋白合成前体途径的碳代谢比例也如此低。因为考虑到不正确的蛋白折叠/糖基化修饰等因素，大部分合成前体并不能有效地转化成目标蛋白。

毕赤酵母表达monellin过程中，在低细胞浓度下启动甲醇诱导，并将诱导温度控制在30 ℃的发酵策略最优，monellin浓度最高。我们分析了此诱导策略与其他诱导策略下的甲醇/能量代谢模式。结果表明，采用该最优策略时，用于monellin前体物质合成和NADH合成的碳流充足；用于支撑monellin合成的能量(NADH)利用效率最高；monellin合成与细胞生长完全耦联，耦联系数α最大且细胞生长速率较高，monellin合成速率最大。该诱导策略还可以缓解热交换压力和供氧负担，有利于降低发酵成本。