熊果酸对食管癌KYSE150细胞增殖、凋亡的影响及其机制

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作者：

卢丹

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摘要：

背景及目的 食管癌是目前对人类健康和生命构成严重威胁的恶性肿瘤之一,在各种恶性肿瘤导致的死亡中食管癌占第六位,在我国一些高发地区居于各种恶性肿瘤的首位.近10年来,对其病因和发病机制的研究虽已取得重大进展,但迄今尚未完全阐明,发病率和死亡率在部分地区仍居高不下.食管癌是恶性程度最高的胃肠道肿瘤之一,全世界每年约有三十万人死于此疾病.我国开展食管癌外科治疗及化学治疗已有数十年,尽管食管癌的化学治疗对改善预后有着极其重要的意义,然而临床疗效较好的药物并不多,因此寻找一种有效安全的药物成为食管癌化疗的热点之一. 熊果酸作为一种存在于多种中草药中的生物活性成分,已被证明具有抗肿瘤,抗炎,止痛,护肝,抗高血压,降血糖,抗氧化,保护心脑血管等药理作用,并有望成为一种高效低毒的多用途新药.大量研究表明,熊果酸可诱导子宫内膜癌,大肠癌,前列腺癌,肺癌,淋巴瘤等多种恶性肿瘤细胞凋亡,在一定程度上揭示了熊果酸的抗肿瘤效应,但关于熊果酸对食管癌的作用却少有研究.本实验观察了熊果酸在体外对食管癌细胞系KYSE150的作用,研究熊果酸是否对食管癌细胞系KYSE150具有增殖抑制作用,及熊果酸对食管癌细胞凋亡及周期分布的影响,并进一步探讨其作用的分子机制,为进一步研究熊果酸抗肿瘤的相关分子机制打下良好的基础. 材料和方法 1细胞增殖抑制实验(熊果酸对人食管癌细胞作用的体外实验研究):采用MTT法,将对数生长期的KYSE150细胞调整细胞浓度为1.0×105/ml(常规培养人食管癌细胞系KYSE150细胞),待贴壁生长后分为三组:①实验组:加入熊果酸使终浓度为10,20,30,40,50μmol/L;②阴性对照组:加入RPMI-1640培液;O溶剂对照组:加入0.1%DMSO.每组设4个复孔,分别于熊果酸干预24,48,72小时后,检测各组细胞增殖抑制率的差异. 2细胞凋亡率和细胞周期的测定常规培养人食管癌细胞系KYSE150细胞,对照组加入RPMI-1640培养液,实验组加熊果酸使其终浓度为40μmol/L.分别于24,48,72小时干预后收集各对照组和实验组的3瓶KYSE150细胞,采用流式细胞仪检测KYSE150细胞凋亡率及细胞周期分布的情况. 3 Bcl-2, Bax和CyclinD1 mRNA在熊果酸处理前后的表达变化采用RT-PCR检测常规培养人食管癌细胞系KYSE150细胞,对照组加入RPMI-1640培养液,实验组加入终浓度为10,20,30,40,50μmol/L的熊果酸作用于细胞48小时后,各收集对照组和实验组3瓶KYSE150细胞,用RT-PCR技术检测Bcl-2, Bax和CyclinD1 mRNA表达情况. 4数据应用SPSS 13.0软件统计分析,率的统计学分析采用X2检验,多组间的比较采用单因素方差分析.以α=0.05为检验水准,当P0.05为差异有统计学意义. 结果 1 MTT:结果表明熊果酸对食管癌KYSE150细胞具有增殖抑制作用,且呈浓度及时间依赖性,差异有显著性(P0.05).熊果酸处理24,48和72小时后的IC50分别为84.14μmol/L,36.72μmol/L和25.06μmol/L.50μmol/L熊果酸作用72小时后,KYSE150细胞增殖几乎停止. 2 FCM:结果表明经40μmol/L熊果酸作用KYSE150细胞后,随着时间的延长,细胞凋亡率逐渐升高,S期细胞的比例逐渐下降,G0/G1期细胞的比例逐渐增加,主要呈现G0/G1期阻滞,并存在时间依赖性. 3 RT-PCR:结果表明经熊果酸作用KYSE150细胞48小时后,随着药物浓度的增加Bcl-2 mRNA表达降低,Bax mRNA表达增加,Bcl-2/Bax比值降低,CyclinD1 mRNA表达降低. 结论 1 MTT试验结果提示熊果酸在体外具有抑制人食管癌细胞株KYSE150增殖的作用,且具有时间剂量依赖性. 2流式细胞结果提示,熊果酸作用人食管癌细胞株KYSE150细胞后,可以明显影响其细胞周期,将KYSE150细胞阻滞于G0/G1期,其机制为熊果酸降低了食管癌细胞周期调节关键基因CyclinD1 mRNA的表达. 3流式细胞术分析显示熊果酸可以诱导人食管癌细胞株KYSE150凋亡.其机制为熊果酸减少Bcl-2 mRNA和增加Bax mRNA的表达水平,降低Bcl-2/Bax的比值,是熊果酸对食管癌发挥抗肿瘤作用的分子机制.

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关键词：

熊果酸 KYSE150细胞 细胞凋亡 Bel-2 CyclinD1 Bax

学位级别：

硕士

学位年度：

2010

DOI：

10.7666/d.y1834498

被引量：

1