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已有 3169 次阅读 2023-7-28 19:33 |个人分类:【其他】|系统分类:科研笔记

1. 凋亡刺激 细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，能帮助多细胞生物去除不需要的或异常的细胞。它在生物体进化、内环境稳定以及多个系统发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。 在实验中，星孢菌素 (Staurosporine) 刺激和紫外线（UV）刺激是诱导细胞凋亡最常用的两种方法。而 Caspase 蛋白家族则是细胞凋亡过程中最关键的蛋白之一，为此可以 Caspase 蛋白的变化间接反应细胞凋亡的情况。

a) 星孢菌素刺激 Jurkat 细胞 实验方法：以 Jurkat 细胞为实验对象，待细胞密度达到 1.0X106 个 /mL 时，加入星孢菌素终浓度 1μM，刺激时间 6h，按时间梯度取样，以 Caspase 3 抗体（Cat.No./19677-1-AP，Proteintech）检测 Caspase 3 蛋白水平的变化。 实验结果：星孢菌素刺激之后，随着刺激时间加长，全长 Caspase 3 的蛋白水平不断下降；剪切体 Caspase 3 的蛋白含量不断增加，间接反映了细胞凋亡的发生和加强。  

b) 紫外线刺激 HeLa 细胞 实验方法：以 HeLa 细胞和为实验对象，待细胞汇合度达到 90% 时，使用超净工作台紫外灯刺激细胞，刺激时间 2h，对照组正常光照培养；以 Caspase 12 抗体（Cat.No./ 55238-1-AP，Proteintech）检测 Caspase 12 蛋白水平的变化。 实验结果：UV 刺激之后，全长 Caspase 12 和其剪切体蛋白水平显著上升，间接反映了细胞凋亡的发生和加强。

2. 自噬刺激 自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程。细胞借此实现自身的代谢需要和某些细胞器的更新。饥饿胁迫和雷帕霉素（Rapamycin）处理等可引起自噬（增强自噬小体形成）；氯喹或巴弗洛霉素 A1 等溶酶体抑制剂可以抑制自噬（抑制自噬小体和溶酶体结合）。LC3 蛋白，尤其是脂化后的 LC3-Ⅱ是自噬小体膜组分，可用于自噬小体标记，同时脂化后的 LC3-Ⅱ和未脂化的 LC3-Ⅰ二者含量的变化也可体现细胞自噬的水平。

a) 无血清培养 HepG2 和 HEK293 细胞 无血清培养所造成的营养缺失可诱导细胞出现自噬，形成自噬小体。低浓度氯喹可以改变溶酶体的 pH 值，阻止自噬小体和溶酶体的结合，从而使自噬小体处于可观察状态。 实验方法：实验组 HEK293 和 HepG2 无血清培养 2 h 后换新鲜培养基，加入终浓度为 50 μM 的氯喹培养 24 h； 对照组 HEK293 和 HepG2 无血清培养 2 h 后换新鲜培养基，24 h 后同实验组一起收细胞。刺激完成后以 LC3 抗体（Cat.No./ 14600-1-AP，Proteintech）通过免疫荧光（IF）实验直接观测自噬小体的数目或 WB 实验检测 LC3-Ⅱ 和 LC3-Ⅰ 的蛋白水平。 实验结果：IF 实验显示氯喹处理的细胞中 LC3 蛋白由未处理时的均匀而弥散分布转变成聚集的环形和点状亮斑结构（自噬小体）；同时 WB 实验显示氯喹处理后细胞脂化的 LC3-Ⅱ含量升高；两个实验均表明处理之后自噬水平大大提高。

b) 雷帕霉素刺激 293T 细胞 雷帕霉素作为经典的自噬诱导剂可通过抑制 mTOR 信号通路进而增强自噬的发生。 实验方法：刺激前 24 h 铺细胞，在细胞汇合度 70%-90% 开始刺激，加入终浓度分别为为 20 nM、100 nM、500 nM 的雷帕霉素刺激 293T ，同时还可设置时间梯度 0h，6h，18h，24h；另设对照实验，即可同上实验，以 LC3 蛋白通过 IF 或者 WB 监测细胞自噬的发生和变化。

c) 羰基氰-化物间氯-苯腙（CCCP）增强线粒体自噬 羰基氰-化物间氯-苯腙（CCCP）作为一种氧化磷酸化解偶联剂能抑制线粒体电子传递链，影响线粒体蛋白合成。CCCP 可以促进 PINK1 蛋白的表达，PINK1 蛋白进一步刺激泛素分子的 65 位丝氨酸磷酸化，募集并激活 parkin，进而诱导线粒体自噬。 实验方法：刺激前 24 h 铺细胞，细胞汇合度 70%-90% 开始刺激，使用终浓度为 10 μM CCCP 刺激 24 h，设置好对照 (CCCP 以 DMSO 稀释，母液浓度 10mM) 。以 Phospho-Ubiquitin(Ser65) 抗体（Cat.No./28375-1-AP, Proteintech）WB 实验检测 65 位丝氨酸磷酸化的泛素分子的蛋白水平。 实验结果：CCCP 刺激之后，泛素的 65 位丝氨酸磷酸化水平显著上升，表明线粒体自噬水平增强。

3. 内质网应激刺激 内质网应激（ER stress）表现为内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集以及钙离子平衡紊乱，可激活未折叠蛋白反应、内质网超负荷反应和 caspase-12 介导的凋亡通路等，既能诱导糖调节蛋白 GRP78、GRP94 等内质网分子伴侣表达而产生保护效应 ，亦能独立地诱导细胞凋亡。在内质网应激发生时，相关蛋白 ATF4 和 CHOP 的表达水平会发生显著变化，故可用于内置网应激检测靶标。

a）衣霉素刺激 PC-3 细胞 实验方法：衣霉素是诱导内质网应激发生的主要刺激物。实验前 24h 铺细胞，细胞汇合度 70%-90% 开始加入衣霉素刺激，刺激浓度分别为 2 μg/ml， 4 μg/ml，刺激时间 24 h，对照组加入等体积 DMSO。以 CHOP 抗体（Cat.No./: 15204-1-AP，Proteintech）WB 实验检测 CHOP 蛋白的表达水平。 实验结果：随着衣霉素浓度升高，CHOP 蛋白的表达水平也越高，表明细胞的内置网应激水平也在提升。

b）毒胡萝卜素刺激 HepG2 细胞 实验方法：毒胡萝卜素（Thapsigargin）同样可以有效诱导内质网应激发生。实验前 24 h 铺细胞，细胞汇合度 70%-90% 时开始刺激，使用终浓度为 1 μM Thapsigargin 刺激 24 h，设置好对照（Thapsigargin 以 DMSO 稀释，母液浓度 1mM），以 ELISA 试剂盒（Human ATF4 ELISA Kit，CatNo./ KE00147，Proteintech）检测内质网应激相关蛋白 ATF4 的表达水平变化。 实验结果：ELISA 实验结果显示，毒胡萝卜素刺激后，ATF4 的蛋白水平有显著的提升，表明内质网应激正在发生中。

4. 细胞周期 G0 期，G1 期，S 期，G2 期和 M 期等是细胞周期的 5 个阶段，调控着细胞的生长、分裂。细胞周期的调控刺激，掌控着细胞的命运。

A）Nocodazole 刺激 HeLa 细胞 实验方法：Nocodazole 是常用的细胞中期阻断剂，可以将细胞周期阻断在 M 期，使得细胞周期同步。实验时加入终浓度为 1 μg/ml Nocodazole 到汇合度为 70% 左右的 HeLa 细胞，分别培养 48 h、24 h、16 h 后收细胞，对照组不刺激。

B）BrdU 刺激 HeLa 细胞 溴脱氧尿苷（BrdU）是一种合成核苷，类似于胸腺嘧啶。它可以被合并到新合成的复制细胞的 DNA(在 S 期，DNA 复制过程中取代胸苷）。因此，BrdU 被用于测定出生日期和监测细胞增殖。 实验方法：在 HeLa 细胞中加入工作浓度为 0.03 mg/ml 的 BrdU，37℃培养 2 h，后收细胞固定，2 M HCl 处理 30 min，对照组不刺激。通过 IF 实验以 BrdU 抗体（Cat.No./ 66241-1-AP，Proteintech）检测 BrdU 的插入情况。 实验结果：BrdU 聚集在细胞核中，标记正在增殖的细胞。

C）CaCl2 刺激 EC109 细胞 实验方法：刺激前 24h 铺细胞，刺激时细胞汇合度 70%-90%，加入终浓度为 0.06 mM 及 1.8 mM CaCl2 培养基分别培养 0 d、3 d、5 d、7 d、10 d 收细胞，随后通过 WB 实验和 IF 实验检测 ZNF750。

D）胰岛素刺激 HeLa 细胞 实验方法：胰岛素可通过 mTOR 信号通路调控细胞周期和细胞增殖。故以胰岛素刺激细胞同样会引起细胞周期的相关变化。刺激前 24h 铺细胞，刺激时细胞汇合度 70%-90%，加入终浓度为 100nM 胰岛素刺激 15min 后收细胞，设置无刺激对照。

5. 温度刺激 鸟类和哺乳动物由于体温调节机制比较完善，能够在环境温度变化的情况下保持体温稳定，被称之为恒温动物。在受到低温环境刺激时，为维持体温恒定，生物体会通过各种通路调控细胞代谢，部分蛋白水平会发生明显改变。最典型的就是 CIRBP（cold inducible RNA binding protein），为此以 CIRBP 作为低温响应检测指标。 低温刺激 实验方法：以 HepG2 细胞为实验材料。取相同培养条件的细胞和相同数量的细胞，在 4℃（低温）、25℃（室温）、37℃（体温）条件下培养 1 小时，随后收集细胞，制备裂解液，以 CIRBP 抗体（Cat.No./: 10209-1-AP，Proteintech）通过 WB 检测 CIRBP 的蛋白水平。 实验结果：随着温度降低，CIRBP 蛋白的表达量越高，表明细胞对低温的响应越强烈。

6. 氧含量刺激  氧气是维持细胞和生物体活动所需能量来源的重要物质基础，也是机体新陈代谢启动机制的关键之一。低氧环境可以增强呼吸强度，抑制生理运作；过氧化环境则会促进衰老。 a) 低氧刺激 实验方法：CoCl2 是一种化学性低氧模拟剂，在多种培养细胞中能模拟低氧状况。实验前 24 h 铺细胞，待细胞汇合度 70%-90% 时开始刺激。使用终浓度为 250 μM、400 μM 的 CoCl2 溶液分别刺激 6 h，对照组不加 CoCl2 。HIF1a 是细胞对缺氧反应的主要调节因子，在缺氧条件下蛋白水平会显著变化，并且亚细胞定位也会改变，可作为低氧刺激检测指标。 实验结果：在 CoCl2 处理之下，以 HIF1a 抗体（Cat.No./ 20960-1-AP，Proteintech）检测 HIF1a，结果表明 HIF1a 的蛋白水平显著上升，同时亚细胞定位由胞质向核内转移，表明细胞对低氧刺激有明显响应。

b）过氧刺激 实验方法：以 HeLa 细胞和 HEK293 细胞为实验对象；使用利尿酸（ethacrynic acid，EA）刺激细胞产生胁迫。刺激前 24h 铺细胞，细胞汇合度到 70%-90% 开始刺激，加入终浓度为 100 μM EA 刺激 5 h 后收样，设置无刺激对照。TDP43 蛋白的磷酸化是很多神经退行性疾病的一个指标，同时它也是细胞响应过氧应激的一个重要角色。 实验结果：EA 刺激之后，以 TDP-43 抗体（Cat.No./ 22309-1-AP，Proteintech）检测 TDP43 ，结果显示 TDP-43 蛋白被磷酸化（50 kDa），并被剪切成 TDP35 的磷酸化片段（35 kDa），表明细胞正在响应 EA 给细胞造成的刺激。

7. 炎症刺激 炎症是机体对于刺激的一种防御反应。细菌、病毒、真菌、寄生虫等生物因子，酸、碱、坏死组织的分解产物等化学性因子，高温、低温、放射线物质、紫外线和机械损伤等物理因子都可以导致炎症反应。 在实验中，我们常以下面几种化合物或者化合物组合来刺激细胞建立炎症模型。在炎症发生之后，细胞中的 PD-L1 蛋白和 IDO1 蛋白的水平会发生明显变化，二者可作为炎症检测靶标。

a）PMA 刺激 Jurkat  细胞 实验方法：Jurkat 细胞密度 1.0 x 106 个 /mL，实验组加入终浓度为 10 ng/ml PMA 培养 2 h（PMA 母液以 DMSO 配制），对照组加入等体积 DMSO，2 h 后收细胞制备裂解液。

b）LPS 刺激 HepG2 / U937 / THP-1 细胞 实验方法：刺激前 24 h 铺细胞，刺激时细胞汇合度 70%-90%，实验组使用终浓度为 0.1 μg/ml LPS 刺激 18-24 h，设置无刺激对照。

c）TNF-α 刺激 HUVEC 细胞 实验方法：刺激前 24 h 铺细胞，刺激时细胞汇合度 70%-90%，实验组使用终浓度为 10 ng/ml 刺激 18 h，设置无刺激对照。

d）PHA+LPS 共刺激 实验方法：细胞密度 0.5x106 个 /ml，6 孔板每孔细胞总量 1 x 106 个，PHA 终浓度 10 μg/ml ，LPS 终浓度 50 ng/ml ；刺激时间分别为：PHA 30min+LPS 10min；PHA 1h  +LPS 30min； PHA 1d + LPS 2h；PHA 2d  +LPS 1d；PHA 3d  +LPS 2d。

e）CD3 单抗刺激 Jurkat 细胞（T 细胞活化） 实验方法：刺激时 Jurkat 密度 1.0 x 106 个 /ml，实验组加入 CD3 单抗浓度 15 μg/ml，刺激 6 h 后收细胞，设置无刺激对照。

f）IFN-gamma 刺激 A375 / A549 / HeLa 细胞 实验方法：刺激时细胞密度 1.0 x 106 个 /ml，IFN-gamma（CatNo./ HZ-1301，Proteintech）浓度 15 μg/ml，刺激 48h 后收细胞，设置无刺激对照。通过 PD-L1 抗体（Cat.No./ 66248-1-AP，Proteintech）和 IDO1 抗体（Cat.No./:13268-1-AP，Proteintech）检测二者蛋白水平变化。 实验结果：以 IFN-gamma 刺激 A375 / A549 / HeLa 细胞为例，在刺激之后，细胞中的 PD-L1 和 IDO1 的蛋白水平显著上升，表明细胞正在发生炎症反应。

8. 油酸刺激 脂滴是细胞内中性脂的储存的主要场所，是脂代谢的研究材料。用油酸（Oleic acid）刺激细胞可以诱导脂滴的形成。ADRP/Perilipin 2 是脂滴的标志物。通过 IF 实验利用 ADRP 抗体可以很好地展示细胞中的脂滴。

油酸刺激 实验方法：实验前 24 h 铺细胞，细胞汇合度 70%-90% 开始刺激，使用终浓度为 600 μM 的油酸刺激 19 h，设置对照。以 ADRP 抗体（Cat.No./:15294-1-AP，Proteintech）检测该蛋白的亚细胞定位。 实验结果：油酸刺激之后，细胞胞质中出现大量圆环状的结构，表明在油酸刺激下，细胞中的脂滴数量有显著上升。

本文引自：ProteinTechhttps://ptglab.biomart.cn/news/2992839.htm