β

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）是纤维素酶的重要组分，存在于许多植物体中，与植物细胞生长发育过程中细胞壁的松弛或加固有关，还与植物细胞的信号识别和一些信号分子的产生相联系。β-葡萄糖苷酶不仅具有纤维素的糖化作用，而且与果蔬中很多特殊物质的代谢有密切关系。在该酶的作用下，能使果蔬中许多前体物质如甙类、花青苷、键合态挥发性物质中有效成分的释放出来。

一、目的要求

了解β-葡萄糖苷酶的作用，学习水杨苷水解法测定果蔬组织中β-葡萄糖苷酶活性的原理和方法。

二、基本原理

β-葡萄糖苷酶可将纤维二糖（水杨苷为以葡萄糖苷键连接的纤维二糖）水解成葡萄糖分子。因此，以水杨苷（又称水杨素，Salicin）为底物，利用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定β-葡萄糖苷酶催化其水解形成的还原糖的量，可以测定该酶的催化活性。

三、材料、仪器及试剂

（一）材料

苹果、梨等。

（二）仪器及用具

恒温水浴锅、分光光度计、电子天平、试管、移液管或加液器、具塞刻度试管（25 mL）、容量瓶（200 mL）、烧杯等。

（三）试剂

1．50 mmol/L、pH 5.5醋酸钠缓冲液

母液A（0.2 mol/L醋酸溶液）：量取11.55 mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1 000 mL。

母液B（0.2 mol/L醋酸钠溶液）：称取16.4 g无水醋酸钠（或称取27.2 g三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、稀释至1 000 mL。

取6.8 mL母液A和43.2 mL母液B混合后，调节pH至6.0，稀释至200 mL。

2．提取缓冲液（含1.8 mol/L NaCl）

称取10.5 g NaCl，用50 mmol/L、pH 5.5醋酸钠缓冲液溶解、稀释至100 mL，摇匀。

3．50 mmol/L、pH 4.5柠檬酸缓冲液

母液A（0.1 mol/L柠檬酸溶液）：称取21.01 g C6H8O7·H2O，溶解、稀释至1 000 mL。

母液B（0.1 mol/L柠檬酸钠溶液）：称取29.41 g Na3C6H5O7·2H2O，溶解、稀释至1 000 mL。

取54.25 mL母液A和45.75 mL母液B混合，稀释至200 mL。

4．1%水杨苷溶液

准确称取1.0 g水杨苷，用50 mmol/L、pH 4.5的柠檬酸缓冲液溶解、稀释至100 mL，4℃保存备用。

5．3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂

参照DNS试剂测定还原糖实验中的方法配制。

四、实验步骤

（一）酶液制备

称取10.0 g果蔬样品，置于经预冷的研钵中，加入20 mL经预冷的95%乙醇，在冰浴条件下研磨匀浆后，全部转入到离心管中，低温放置10 min，然后于4 ℃、12 000×g离心20 min。倾去上清液，向沉淀物中再加入10 mL 经预冷的80%乙醇，振荡，低温放置10 min，然后在相同条件下离心。再取倾去上清液，向沉淀物中再加入5 mL 经预冷的提取缓冲液，于4℃放置提取20 min，再经过离心后收集上清液即为酶提取液，4℃保存备用。

（二）活性测定

取1.5 mL 0.5%水杨苷溶液和0.5 mL酶提取液于25 mL具塞刻度试管中，在37 ℃水浴中保温1 h。取出后，立即向试管中加入1.5 mL DNS试剂以终止酶促反应，充分摇匀。然后在沸水浴中煮沸5 min，取出冷却后用蒸馏水稀释至25 mL，充分混匀，在波长540 nm处测定显色液的吸光度值。

以煮沸5 min酶液代替活性酶液作为对照，进行同样的操作、测定，记录吸光度值。重复三次。

五、实验结果与计算

根据样品管和对照管溶液吸光度值，在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数。β-葡萄糖苷酶活性以每小时每克鲜重（FW）果蔬组织样品中酶在37 °C催化水杨苷水解形成还原糖的微克数表示，即µg·h-1·g-1 FW。计算公式：

式中：

C ——从标准曲线查得的葡萄糖量，mg；

V ——样品提取液总体积，mL；

Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；

t ——酶促反应时间，h；

W ——样品重量，g。

一、目的要求

了解β-葡萄糖苷酶的作用，学习对-硝基苯葡萄糖苷水解法测定果蔬组织中β-葡萄糖苷酶活性的原理和方法。

二、基本原理

在β-葡萄糖苷酶作用下， P-硝基苯-β-吡喃葡萄糖苷化合物可被水解，并释放出P-硝基苯酚。在碱性条件下，P-硝基苯酚呈黄色，可在波长400 nm处测定。因此，通过测定P-硝基苯酚的量，可以确定β-葡萄糖苷酶活性。

三、材料、仪器及试剂

（一）材料

苹果、梨等。

（二）仪器及用具

恒温水浴锅、分光光度计、电子天平、试管、移液管或加液器、具塞刻度试管（25 mL）、容量瓶（200 mL）、烧杯等。

（三）试剂

1．5 mmol/L P-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（P-Nitrophenyl-β-D-Glucopyranoside，PNPG）溶液

称取150.7 mg P-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷，用蒸馏水溶解、稀释至100 mL，低温下（4℃）可保存2周。

2．150 µmol/L P-硝基苯酚（P-Nitrophenol）标准溶液

称取21.0 mg P-硝基苯酚，溶解、稀释至1 000 mL。

3．1 mol/L碳酸钠

称取10.6 g 碳酸钠，溶解、稀释至100 mL。

四、实验步骤

（一）标准曲线的制作

取6支试管，编号，按表16加入各试剂，混合后，于波长400 nm处测定溶液的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，P-硝基苯酚微摩尔数为横坐标，制作标准曲线，求得线性回归方程。

表16.绘制P-硝基苯酚标准曲线各试剂加入量

（二）酶液制备

同水杨苷水解法测定果蔬组织中β-葡萄糖苷酶活性。

（二）活性测定

取0.5 mL 5 mmol/L P-硝基苯-β-吡喃葡萄糖苷溶液和0.5 mL酶提取液于试管中，在37℃水浴中保温30 min。取出后立即向试管中加入2.0 mL 1 mol/L碳酸钠溶液以终止酶促反应，充分摇匀，冷却。按照制作标准曲线的方法，在波长400 nm处测定混合液的吸光度值。重复三次。

同时取0.5 mL 5 mmol/L P-硝基苯-β-吡喃葡萄糖苷溶液和0.5 mL相应的酶提取液于试管中，加入2.0 mL 1 mol/L碳酸钠溶液，混合，然后在37℃水浴中保温30 min。取出冷却后测定，作为本底对照。

五、实验结果与计算

根据样品测定溶液与对照溶液吸光度值差值，在标准曲线上查出相应的P-硝基苯酚微摩尔数。β-葡萄糖苷酶活性以每小时每克鲜重（FW）果蔬组织样品在37°C催化P-硝基苯-β-吡喃葡萄糖苷水解释放出的P-硝基苯酚微摩尔数表示，即µmol·h-1·g-1 FW。计算公式：

式中：

C ——从标准曲线查得的P-硝基苯酚微摩尔数，µmol；

V ——样品提取液总体积，mL；

Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；

t ——酶促反应时间，h；

W ——样品重量，g。

六、注意事项

1．可用1 mol/L NH4OH溶液（含2 mmol/L EDTA）代替碳酸钠溶液。

2．利用相类似的方法，以P-硝基苯-β-吡喃半乳糖苷为底物，也可以测定另一种重要的水解酶β-吡喃半乳糖苷酶活性。