《食品科学》：天津科技大学张晓维博士等：钙结合卵黄高磷蛋白磷酸肽的制备及其肽钙螯合物的结构表征

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目前，为缓解缺钙引发的健康问题，大量钙补充剂应运而生，其主要是以碳酸钙、葡萄糖酸钙及乳酸钙等为代表的离子钙，虽然其钙含量满足了人体所需量，但钙离子经过小肠时容易产生磷酸钙沉淀，使得生物利用率大大降低。有研究证实，生物活性肽能与钙离子结合，形成较为稳定的肽钙螯合物，可被肠道整体吸收，具有高吸收率和高利用率等特点。因此，高利用率的肽钙螯合物，成为钙补充剂市场上的必然趋势。

我国是鸡蛋产量大国，其中卵黄高磷蛋白（PV）是鸡蛋蛋黄中的一种高度磷酸化的糖蛋白，富含磷酸化丝氨酸残基，形成了极性的酸性结构域，有利于螯合Ca2+、Mg2+、Zn2+等金属离子，进而抑制不溶性金属磷酸盐的形成，使金属离子维持高度溶解状态，从而提高生物利用率。PV是生物活性肽的极好来源，其酶解物可制备高利用率的肽钙螯合物。

天津科技大学食品科学与工程学院，食品营养与安全国家重点实验室，天津市食品质量与健康重点实验室的宋 丽，朱临娴、张晓维*等通过正交试验法优化双酶酶解制备卵黄高磷蛋白磷酸肽（PPP），再制备得到螯合物PPP-Ca，并采用紫外吸收光谱、红外吸收光谱和圆二色谱分析等对其结合特性进行分析。该研究可改善PV 水解度（DH）值低的问题，增加小分子多肽的产率，对PPP作为促钙吸收剂的功能因子应用具有重要意义。

1、酶解前预处理方式对PPP制备的影响

图1显示，在单一胰蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶双酶水解时，DH和钙结合率效果均依次为高温高压组＞碱处理组＞未处理组，表明无论是单一酶酶解还是双酶酶解，高温高压处理均有助于PV进一步被水解，且在双酶酶解中影响最大，得到更多的小分子肽，进而增加肽钙结合的机率。在高温高压处理组中单酶处理的DH达到（12.65±0.48）%，高于已有的研究（10.25%）；双酶处理的DH高达（24.82±0.66）%，相比Huang Xi等报道的结果（19.04±0.55）%较高，这说明高温高压处理可以在一定程度上打开PV内部多聚磷酸化丝氨酸区域和肽键的随机断裂，使得胰蛋白酶和碱性蛋白酶作用位点暴露，降低了磷酸基团对蛋白酶的拮抗作用，提升了酶解效率。单酶和双酶处理的钙结合率分别达到（89.88±0.36）%和（95.88±0.51）%，其变化趋势与DH呈正相关。这可能是因为高温高压处理后的PV在经胰蛋白酶和碱性蛋白酶酶解后产生更多含磷量较高的肽段和小分子质量多肽，进而使更多的PPP与Ca 2+ 结合。

2、碱性蛋白酶酶解条件对PPP制备的影响

由图2A可知，当碱性蛋白酶加酶量小于5%时，DH呈近似线性增加，在5%加酶量时DH高达（24.50±0.61）%；继续增加加酶量其DH变化趋于平缓，这说明底物达到饱和，过量的加酶量对水解效率无显著影响。PPP钙结合率变化趋势与DH变化趋势相似，这说明多肽产量与钙结合率有一定的相关性，在5%加酶量时PPP钙结合率最大，为（93.29±0.34）%。

图2B显示，当反应时间从30 min延长至90 min时，DH和钙结合率分别从（12.78±1.23）%和（92.29±0.50）%增加到（22.70±0.68）%和（94.18±0.47）%，当继续延长反应时间时，钙结合率和DH变化不显著，整体趋势相对比较平缓，这表明酶解反应90 min后基本结束。

反应温度在20～60 ℃，DH和钙结合率先增大后减少，且在40 ℃时达到最大值，分别高达（23.37±0.55）%和（94.42±0.49）%；当反应温度继续增加时，钙结合率和DH均明显降低（图2C），这是由于在酶适宜温度下酶解反应速率随温度升高而升高，超出酶适宜温度后酶会发生不同程度的变性，酶活丧失，从而降低了PV的水解效率，导致小分子肽产量低，进而使得钙结合率降低。

当pH值从7.0增加到9.0时，DH和钙结合率逐渐递增，在pH 9.0时达到最大，分别为（23.74±0.17）%和（94.19±0.45）%；继续提高pH值，过量的碱会使酶的空间结构被破坏，导致酶活力的降低，使得多肽产率降低。以上结果还显示改变酶解条件，肽钙结合率没有DH变化那么显著，可能是因为PPP所携带的磷酸基团分布不均匀导致。

综上所述，反应时间对PPP的制备影响最小，后续实验考虑反应时间90 min，以加酶量5%、反应温度40 min和pH 9为中位数进行酶解正交试验优化。

3、碱性蛋白酶酶解正交试验优化

单因素分析虽分别确定了各因素酶解的最佳条件，但考虑到因素与因素之间可能存在交互作用，因此设计3因素3水平正交试验，研究因素之间对碱性蛋白酶酶解作用的影响，正交试验和极差（R）分析结果见表2。由R值可知，影响DH和钙结合率的因素顺序为B＞A＞C。由K值可知，碱性蛋白酶酶解最优工艺条件为A 2 B 2 C 2 ，即酶解pH 9.0、反应温度40 ℃、加酶量5%。在该条件下进行实验验证求得，DH为（25.45±0.17）%，钙结合率为（93.41±1.10）%。

4、酶解物的分子质量分布情况

从图3得知，未处理的PV分子质量＞35 kDa，这与现有研究一致。处理PV的分子质量主要分布在11～35 kDa，少量分布在5 kDa处。相对于未处理PV，经高温高压处理后的处理PV其分子质量有所下降，这说明高温高压处理导致PV的空间构像被改变或破坏，使得部分结构可能发生降解。多肽1和多肽2的分子质量主要集中在＜11 kDa处；且相较于多肽1，多肽2在此处的条带颜色灰度更深，说明多肽2中含＜11 kDa的肽段含量高于多肽1。此外，图3B条带不清晰且存在明显拖尾现象，这可能是因为高温高压处理后PV中的肽链发生不同程度解离，且经过内切酶作用，导致产生的肽段比较复杂，且多肽分子质量越小越复杂，这些多肽小分子在电泳胶里运动不规则、电泳时间长或染色时间过长，其可能会降解或部分从凝胶上脱离。

5、PPP和PPP-Ca结构表征

紫外-可见吸收光谱分析

如图4所示，PPP和PPP-Ca的紫外吸收光谱有明显差异，PPP在207 nm左右出现最大吸收峰，通常对应PPP中特定的羰基、羧基和酰胺键。相较于PPP，PPP-Ca的紫外吸收峰出现吸收强度增强和红移现象，在216 nm处达到最大，这可能由于Ca 2+ 与发色基团和助色基团相互作用，影响电子跃迁，导致吸收峰红移和强度增强，与之前报道一致，此外还有一种原因可能是过渡金属离子可以吸收紫外线区域的光，进而导致吸收峰强度增加。上述结果表明，PPP与Ca 2+ 相互作用形成了不同于PPP的新化合物。

红外吸收光谱分析

如图5所示，PPP与Ca 2+ 结合后，相较于PPP红外光谱发生了显著变化。在3434.59 cm -1 处特征吸收峰是—NH伸缩振动的变化引起，在结合钙后其红移至3389.7 cm -1 ，表明酰胺中—NH可能与钙离子发生反应，N—Ca键取代氢键导致N—H键延伸。1700～1600 cm -1 内的特征吸收峰是酰胺I带，主要来源于C＝O的伸缩振动，肽钙螯合后其由原来的1654.1 cm-1移动到1652.2 cm-1处，这表明C＝O参与了肽钙的结合，这与文献[43]的报道类似。位于酰胺II带的1543.73 cm -1 处吸收峰红移至1545.1 cm-1处，这可能因为氮原子和钙离子的公共电子相互作用，使碳原子的偶极性增强。在1541.8 cm-1处吸收峰是由C—N键伸缩振动引起，但在结合钙后该吸收峰消失。1467 cm-1是COO—的特征吸收峰，在结合钙离子后此吸收峰消失，这表明羧基氧的非键合自由电子转移到钙离子上，羧基氧参与了钙结合反应。1280.5 cm-1处特征吸收峰是O—H变形振动引起，在PPP与Ca 2+ 结合后此吸收峰消失。在1112.4 cm-1处的吸收峰是P＝O伸缩振动，在与Ca 2+ 结合后蓝移至1092.9 cm-1处且波峰变宽，这可能因为磷酸基团参与了钙螯合反应。基于以上结果分析可推测，PPP与Ca 2+ 结合位点主要是在氨基氮原子、羧基氧原子和磷酸基团上。

圆二色谱分析

由图6可知，PPP与钙离子结合后，吸收峰由202 nm偏移至205 nm，α-螺旋增加至25%，β-折叠增加至34%，β-转角和无规卷曲结构分别减少至0.3%和40.8%，这可能由于之前带负电荷的肽链引入了带正电荷的钙离子，在一定程度上降低了电荷之间的斥力，使得α-螺旋能够稳定存在，同时也有助于肽链的折叠，β-转角和部分无规卷曲结构转变为β-折叠，进一步形成排列紧凑的二级结构。

扫描电镜分析

图7显示，PPP表面较为光滑，多为片状、少部分为球状。PPP-Ca表面粗糙呈絮状，有许多颗粒状和晶体状聚集体，分布更致密，与已有研究结果相似。这可能是由于肽与钙离子之间的配位键导致内部结构发生变化，此外钙离子可以促进肽链聚集折叠，导致形成了更紧密的颗粒，也说明PPP与钙离子结合后形成了新的物质。

Zeta电位分析

由图8可知，PPP和CPP电位分别为（-28.39±0.34）mV和（-28.22±1.23）mV，这是因为PPP和CPP均含有大量的磷酸基团，自身带有大量负电荷。在与钙离子结合后，PPP-Ca和CPP-Ca的电位绝对值有显著下降，分别为（-13.19±0.39）mV和（-17.96±0.81）mV。由于PPP和CPP与钙离子相互作用，多肽中带负电荷的磷酸基团和羧基基团与带正电荷的钙离子相结合，导致多肽表面所带负电荷被中和，整体电位发生明显变化。且相较于CPP-Ca，PPP-Ca的电位值变化更明显，这说明PPP与钙离子的结合能力更强。

结论

碱性蛋白酶的最佳酶解条件为p H 9.0、温度40 ℃、加酶量5%、酶解90 min，在此条件下DH为（25.45±0.17）%，钙结合率为（93.41±1.10）%。基于紫外-可见吸收光谱、红外吸收光谱、圆二色谱和扫描电镜分析，可证实PPP和Ca 2+ 主要通过羧基氧原子、氨基氮原子和磷酸基团相互作用，无规卷曲结构含量降低且转变成β-折叠结构，PPP和钙离子结合后结构变得更加有序，形成致密的聚集体。同时，Zeta电位结果也表明与PPP相比，PPP与Ca 2+ 相互作用后所带负电荷明显减少，进而证实PPP-Ca是不同于PPP的新化合物。本研究表明PPP-Ca有潜力作为一种新型肽钙补充剂。

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通信作者简介

张晓维，天津科技大学食品科学与工程学院助理研究员，硕士生导师。2014年毕业于华中农业大学食品科学与技术学院，随后在江南大学食品学院做博士后研究，2017年进入天津科技大学食品科学与工程学院任教。主要研究方向为动物资源加工与功能食品（蛋品科学）。主持国家项目1项，省部级项目3项，参与多项省部级项目。一作发表11篇论文，其中9篇SCI，授权3项发明专利，参编5部著作。个人详细简介：http://spxy.tust.edu.cn/ch/szdw/jszlyjy/86135.html。

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第一作者简介

宋丽，天津科技大学食品科学与工程学院2020级硕士研究生，主要研究方向：动物资源加工与功能食品。

本文《钙结合卵黄高磷蛋白磷酸肽的制备及其肽钙螯合物的结构表征》来源于《食品科学》2023年44卷6期125-133页，作者：宋丽，朱临娴，宋璐杉，司凯，巩婷婷，刘会平，张晓维。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220414-167。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

图片来源于文章原文及摄图网。

为进一步深入研究食品产业科技创新基础理论，保障食品质量与安全，研发具有营养和保健功能的食品，推动食品科学研究的进步，带动食品产业的技术创新，更好地保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志在成功召开前十届“食品科学国际年会”和四届“食品科学与人类健康国际研讨会”及二十余次食品专题研讨会的基础上，将与国际谷物科技协会（ICC）、南京农业大学、南京财经大学、江苏省农业科学院、徐州工程学院、东南大学营养与食品卫生系于 2023年8月5-6日在中国江苏南京 共同举办“第十一届食品科学国际年会”。

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