大蒜加工废水中蛋白质的分离及其理化性质

卢晓明 张珍涛 李宁阳 陶梦哲 乔旭光

（山东农业大学食品科学与工程学院 山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室 山东泰安271018）

大蒜（Allium sativum L.），别名独蒜、葫蒜、葫等，是葱科葱属植物。我国是大蒜的主要生产国之一，年产量占世界总产量的四分之三，在国际大蒜市场上具有举足轻重的地位。大蒜常用来鲜食，此外还加工成蒜泥、脱水蒜片、蒜汁等制品[1]，其中脱水蒜片是大蒜加工的重要产品之一，对出口创汇、稳定我国大蒜价格、保障大蒜产业健康发展起到重要作用，其产量及出口量逐年上升。2018年我国大蒜年产量为2 227 万t，而每年的大蒜加工量约30 万t，其中出口大约16.4 万t。

在大蒜脱水生产加工过程中，清洗、漂洗和脱水等过程均会产生大量废水，其废水中含有大量的多糖、蛋白质、蒜氨酸等成分，是大蒜加工过程中的主要副产物[2]。现行生产中每生产1 t 脱水蒜片，需消耗30～40 t 水[3]。大蒜加工废水是一种高浓度的有机废水，富含多种成分，尤其含有大蒜素，对细菌具有很强的杀伤力，因此会对后面的生化处理造成严重干扰[4]。据估算，每年全国蒜片加工废水中流失的大蒜蛋白约2.4 万t，大蒜多糖约3万t，大蒜素约120 万t[5]。如果对蒜片加工废水进行高值化利用，将其中含有的功能成分提取分离，经纯化后即可作为高附加值的保健食品和医药原料。

大蒜废水蛋白是指从大蒜切片废水中提取的多种蛋白质的总称。本文针对大蒜废水蛋白的分子质量大小，采用膜分离的方式对其成分组成、分子质量分布、氨基酸组成及其它理化性质进行研究，旨在对蒜片加工副产物进行高值化利用，不仅节约了资源，变废为宝，而且可大大降低生产成本。此外，对大蒜蛋白性质的研究将为大蒜蛋白深加工提供理论依据和参考。

大蒜加工废水；金龙鱼牌大豆油（食品级），益海嘉里食品营销有限公司；牛血清蛋白、考马斯亮兰G250、硼酸、硫酸铜、无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、浓硫酸等均为分析纯级。

流动分析仪，济南博纳生物科技有限公司；Orion 868 型pH 测试仪，梅特勒-托利多有限公司；HH-4 型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；LXJ-IIB 型低速大容量多管离心机，上海安亭科学仪器厂；Adventure 电子天平，奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；IKA T18 分散机，艾卡仪器设备有限公司；Bio-Rad 电泳仪，伯乐生命科技有限公司；DSC 200PC 型差示量热扫描仪，德国耐驰公司；红外光谱仪，赛默飞世尔科技公司；L8900 型氨基酸分析仪，日本日立公司。

1.3.1 大蒜废水蛋白的分离 采用分子质量为10 ku 和30 ku 的膜过滤组件对大蒜废水进行分级分离，测定每段废水中总糖和蛋白的含量，确定大蒜废水蛋白的膜分离条件。采用膜分离与酸沉相结合的方法制备大蒜蛋白，将获得的大蒜废水蛋白真空冻干备用。

1.3.2 大蒜废水蛋白组成测定 蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法（GB 5009.5-2016）；水分含量测定采用直接干燥法（GB 5009.3-2016）；脂肪含量的测定采用索氏提取法（GB 5009.6-2016）；灰分含量的测定采用马弗炉灼烧 （GB 5009.4-2016）；总糖的测定采用苯酚硫酸法[6]。

1.3.3 大蒜废水蛋白分子质量测定 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE） 测定大蒜废水蛋白的分子质量。具体测定方法如下[7-8]：配制20 mg/mL 的大蒜废水蛋白溶液，并与两倍样品缓冲液1∶1 加入离心管，沸水中加热3 min，然后12 000 r/min 离心1 min，取20 μL 上清液上样。采用10 mA 电流恒流电泳，当溴酚兰指示剂前沿线到达分离胶底部约1 mm时停止电泳。将凝胶用考马斯亮兰R250 染色液染色3 h 后脱色。根据标准品分子质量确定大蒜废水蛋白的分子质量分布。

1.3.4 大蒜废水蛋白氨基酸组成分析 参照GB/T 5009.124-2016 中的方法，采用L8900 型全自动氨基酸分析仪测定大蒜废水蛋白中的氨基酸组成。按照式（1）计算。

式中，X——待测蛋白氨基酸含量（g/100 g）；C——待测液中氨基酸含量 （nmol/50 μL）；F——试样稀释倍数；V——水解后试样定容体积（mL）；M——氨基酸分子质量；m——试样质量（g）。

1.3.5 大蒜废水蛋白等电点（PI）的测定 根据蛋白质分子在等电点时溶解性最小，容易聚集沉淀的原理测定大蒜废水蛋白的等电点。具体方法[9]如下：按照表1中的试剂配比依次加入各种试剂后混合均匀，静置一段时间后离心，取上清液测定280 nm 波长下的吸光度。

表1 试剂配比Table 1 The reagent ratio

1.3.6 差示量热扫描（DSC）分析 准确称取5 mg大蒜废水蛋白放入铝质样品盒中，加盖压紧后置于测量池中。升温速率为5 ℃/min，吹扫氮气流量为40 mL/min，测量范围为25～180 ℃。用proteus软件进行图谱采集和数据分析。

1.3.7 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析 参考Liu 等[10]的研究方法，取5 mg 大蒜废水蛋白与200 mg KBr 研磨均匀，压片，采用傅里叶红外光谱仪对蛋白进行红外扫描。扫描范围：4 000～400 cm-1；分辨率：4 cm-1。扫描次数：32 次。用Opus 6.5 软件分析。

1.3.8 大蒜废水蛋白溶解性测定 称取0.5 g 大蒜废水蛋白，加入30 mL 蒸馏水，分别调节pH、温度、盐浓度，室温下磁力搅拌60 min，5 000 r/min离心10 min，将上清液转移并定容至50 mL。测定氮溶解指数。具体计算公式如下：

式中，N1——样品中水溶性蛋白含量（mg）；N2——样品粗蛋白含量（mg）。

1.3.9 蛋白质乳化性及乳化稳定性测定 配制60 mL 0.4%的蛋白溶液，调节pH 值分别为2，4，6，8，10，12，加入10 mL 大豆油，10 000 r/min 下均质1 min。准确吸取50 μL 底部乳状液于试管中，立即加入10 mL 0.1%的SDS 溶液，充分混匀后，在500 nm 波长处测定吸光度值A1，乳化性以乳化活性指数EAI 表示[11-12]，10 min 后，再次测定其吸光度A2，乳化稳定性以ES 表示，按式（3）、式（4）计算。

1.3.10 蛋白质起泡性及泡沫稳定性的测定 配制50 mL 1%的蛋白溶液，调节pH 值分别为2，4，6，8，10，12，测定其在100 mL 量桶中的高度为h1，10 000 r/min 下均质1 min 后立刻转移至量桶内，测定此时泡沫高度为h2，静置30 min，测定泡沫高度为h3，计算起泡性和泡沫稳定性[13-14]。按式（5）、式（6）计算。

所有试验均重复3 次。采用Excel 软件作图，并采用SPSS 统计软件进行显著性分析。

大蒜加工废水中主要含有大蒜多糖及蛋白质两种成分，采用膜过滤方式对其分子质量分布进行研究。从图1可以看出大蒜加工废水中蛋白质的分子质量主要分布在30 ku 以上，含量占总蛋白含量的99.50%；而对比糖类物质的分子质量分布发现其主要分布在30 ku 以下，占到总糖含量的83.48%，特别是分子质量在10 ku 以下的糖类含量占总糖含量的54.13%。从结果可以看出，大蒜蛋白质与糖类的分子质量分布不同，采用30 ku 的膜过滤组件结合酸沉法可以基本达到糖类与蛋白质分离的目的。

图1 大蒜废水总糖和蛋白质分子质量分布Fig.1 Mw distribution of total sugar and protein in garlic wastewater

从表2可以看出，采用膜分离与酸沉相结合的方法获得的大蒜废水蛋白含量达72%以上，还含有水分、糖类等其它物质，特别是糖类物质含量占到13.49%，推测原因为其与蛋白质结合形成糖蛋白，在膜过滤的过程中难以分离。

表2 大蒜废水蛋白组成成分Table 2 Constituent compositions of garlic protein

由图2可知，当pH=3.86 时，吸光度值最低，意味着此时上清液中蛋白质含量最少；而当pH＜3.86 时，随pH 值的增加吸光度逐渐减小；pH＞3.86 时，随pH 值的增加吸光度逐渐增大；由于蛋白质在等电点处溶解度最低，使得溶液中的蛋白吸光度最低，可得大蒜废水蛋白的等电点为3.86。

对大蒜废水蛋白进行SDS-PAGE 分析，由图3可知，大蒜废水蛋白结构中形成了2 条条带，分子质量分别为31.9 ku 和48.4 ku，其中48.4 ku 的条带着色较深，相对含量较高。有研究结果显示从大蒜中分离的可溶性蛋白分子质量主要在10～55 ku 范围内[15]，本文分离得到的条带均在此范围内。

图2 大蒜废水蛋白的等电点Fig.2 Isoelectric point of protein in garlic wastewater

由表3可以看出，大蒜废水蛋白中约含有16种氨基酸，其中含量最高的氨基酸为谷氨酸，占大蒜废水蛋白含量的10.87%，谷氨酸在生物体的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动植物及微生物的许多重要化学反应，是生物体内氮代谢的基本氨基酸之一[16]。氨基酸含量次之的为天冬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、赖氨酸等，其中，亮氨酸缺乏会导致低血糖[17]，赖氨酸能够促进胃酸分泌，增强食欲。而大蒜废水蛋白中具有防癌、抗癌活性的含硫氨基酸（甲硫氨酸和半胱氨酸）含量较低。

氨基酸评分值越接近100，与WHO/FAO 评分模式氨基酸组成越接近，蛋白质价值就越高。由表4可知，甲硫氨酸评分为26.28，是该蛋白的第一限制氨基酸；赖氨酸评分为104.72，高于鱼（75）、大豆（46）、花生（43）、糙米（56）、全粒小麦（48）、全粒玉米（40）、马铃薯（48）的氨基酸评分[18]。因此，将大蒜蛋白作为一种食物辅料加入到各种食品中会大大提高其营养价值。

图3 蛋白质的SDS-PAGE 电泳图谱Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of proteins

表3 大蒜废水蛋白的氨基酸组成Table 3 Amino acid composition of protein in garlic wastewater

表4 大蒜废水蛋白必需氨基酸氨基酸组成评价Table 4 Amino acid score （AAS） of garlic wastewater protein

图4是大蒜废水蛋白热变性曲线。一般来说，蛋白样品在升温过程中结构若发生变化，样品吸热，在DSC 曲线上会产生一个吸热峰，DSC 曲线上显示的转变温度即蛋白结构发生转变的温度[19]，可表征蛋白质的热稳定性。热焓即焓变，是样品发生转变前、后的ΔH（图中吸热峰的峰面积）与蛋白质有序二级结构的含量有关[20]。一般来说，蛋白热变性焓越小，蛋白质变性程度越小。由图4大蒜分离蛋白热变性曲线可以看出，其变性温度为73.2℃，热焓变ΔH 为11.87 J/g。图3中吸热峰的出现表明大蒜废水蛋白分子由于加热而经历解折叠，即从天然态到变性态的构象转变过程，蛋白质变性温度与其β-折叠结构含量呈正相关，蛋白质变性过程中热能的变化主要源于分子间氢键的断裂[21-25]，大蒜废水蛋白的变性焓较高，证明其有序结构所占比例较高。

由图5可见，酰胺A 带出现在3 270 cm-1处，而且只有一个吸收峰，说明是仲胺的伸缩振动。酰胺I 区（1 600～1 700 cm-1）蛋白二级结构内彼此重叠。而酰胺III 区（1 220～1 330 cm-1）不受水分子的干扰。在1 340～1 290 cm-1范围内，属于α-螺旋结构，大蒜废水蛋白在1 310 cm-1处具有吸收峰，表明其存在α-螺旋结构；在1 248～1 220 cm-1范围内，属于β-折叠结构[26]，大蒜废水蛋白在1 240 cm-1处具有吸收峰，表明其存在β-折叠结构；比较两者吸收峰的相对强度，可以看出大蒜蛋白β-折叠结构所占比例远大于α-螺旋结构，这与岳晶念[27]研究基本一致。

图4 大蒜废水蛋白的热变性曲线Fig.4 Thermal denaturation curve of protein in garlic wastewater

图5 大蒜废水蛋白红外光谱图谱Fig.5 FT-IR spectra of protein in garlic wastewater

图6 不同pH 下大蒜废水蛋白的溶解性Fig.6 Effects of pH on NSI of protein

2.8.1 大蒜废水蛋白溶解性 蛋白质溶解性的高低会影响蛋白质生理功能的强弱，而在不同pH 条件下其溶解性不同。由图6可知，随着溶液pH 值的升高，大蒜废水蛋白的溶解性呈先降低后升高的趋势，在pH 4.0 大蒜废水等电点附近时，大蒜废水蛋白溶解性最低，在等电点左侧，溶解度随着pH 值的升高而降低，在等电点右侧随着pH 值的升高而升高。当pH 在等电点的两侧时，蛋白质分别以负离子和正离子的状态存在，相互之间的斥力作用和水合作用能够促进蛋白质的溶解。当pH值大于10.0 时，大蒜废水蛋白的溶解度超过80%，这与大蒜废水中含有较多的碱性蛋白有关，总体来说，在碱性条件下，大蒜废水蛋白的溶解性优于其在酸性条件下的溶解性。

2.8.2 大蒜废水蛋白的乳化性及乳化稳定性 蛋白质具有乳化剂的特征结构，在蛋白质的分子中同时含有亲水和亲油基团，降低水和油的表明张力。此外，蛋白质还能降低水和空气中的表面张力，即存在乳化稳定性。蛋白质的特殊结构使其可以作为一种表面活性剂[28-29]。由图7可以看出，在碱性条件下，大蒜废水蛋白与大豆分离蛋白的乳化性和乳化稳定性基本一致；在酸性条件下，大蒜废水蛋白的乳化性和乳化稳定性均高于大豆分离蛋白，且在pH 4 附近大蒜废水蛋白的乳化性和乳化稳定性最低，由于蛋白质的乳化性与溶解性成正相关，由蛋白分子表面带电荷多少决定[30]。当蛋白溶解性小时，蛋白无法与油脂形成乳化液。

2.8.3 大蒜废水蛋白起泡性及泡沫稳定性 蛋白质的起泡性是指能降低气-液界面表面张力而帮助形成气泡的能力[31]。泡沫稳定性是指蛋白质维持泡沫稳定存在的能力。从图8可以看出，大蒜废水蛋白和大豆分离蛋白的起泡性和泡沫稳定性均随pH 值的增加呈现先下降后升高的趋势，且大豆分离蛋白的起泡性略高于大蒜废水蛋白。在等电点附近（pH 4）时，大蒜废水蛋白起泡性及泡沫稳定性最低，分别为63.55%和20.45%。而在远离等电点的条件下，大蒜废水蛋白生成的泡沫细腻均匀，稳定性较好。在偏离等电点的pH 条件下蛋白带净负或净正电荷，从而导致分子间静电斥力增加而削弱了分子的疏水相互作用，分子柔性增大，有利于其更快地吸附至气液界面，从而增强起泡能力[32-33]。

图7 温度对乳化性及乳化稳定性的影响Fig.7 Effect of temperature on emulsification and emulsion stability

图8 pH 对起泡性及泡沫稳定性的影响Fig.8 Effects of pH on foaming and foam stability

大蒜废水中蛋白质主要分布在30 ku 以上，而糖类主要分布在30 ku 以下，因此采用30 ku 的膜过滤组件可以达到分离的目的。通过膜过滤和酸沉相结合的方法得到纯度为72.11%的大蒜废水蛋白，其分子质量为31.9 ku 和48.4 ku，由16种氨基酸组成，其中谷氨酸含量最多占10.87%，其次为天冬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸，甲硫氨酸是该蛋白的第一限制性氨基酸。大蒜废水蛋白的等电点为3.86；DSC 分析发现其变性温度为73.2 ℃，热焓变ΔH 为11.87 J/g；通过傅里叶变换红外光谱分析发现其具有α-螺旋和β-折叠结构，且β-折叠结构所占比例远大于α-螺旋结构。对大蒜废水蛋白基本性质研究发现大蒜废水蛋白具有良好的溶解性、乳化性、乳化稳定性、起泡性和泡沫稳定性。上述研究初步确立了大蒜废水蛋白的基本性质，为进一步开发大蒜废水蛋白，提高大蒜加工废水附加值提供理论依据和技术参考。

中国食品学报2020年7期