糖聚合物，登上Nature系列综述！

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近年来，受自然界中折叠生物聚合物的启发，化学家们开始探索开发具有可编程三维形状和聚集倾向的天然和非天然肽或核酸序列，以创建复杂的人工系统。这一领域的起步可追溯至约30年前，当时开发出能够折叠成稳定的三维构象的小型人工肽序列。为描述这些序列以及任何在溶液中折叠为构象有序状态并由非相邻单体单元之间的非共价相互作用稳定的离散合成寡聚体，术语“折叠聚合物”被创造出来。随着非自然氨基酸的引入，这些人工生物分子有望稳定特定的几何构型和超分子结构。这些折叠聚合物不仅揭示了自然蛋白质相互作用的关键方面，还构成了能够执行特定功能的人工系统的骨架，广泛应用于纳米技术和医学科学等领域。

然而，与此相比，碳水化合物（也称为糖类或多糖）在构建可编程体系结构方面的潜力尚未得到充分开发。尽管碳水化合物拥有多种单糖、多个羟基和手性中心，可提供多种选择，但迄今为止，这些独特的特性在材料科学和超分子化学中受到了较少关注。此外，碳水化合物的合成复杂耗时，自动化技术相对较少，这给折叠聚合物和超分子系统的开发带来了挑战。然而，近年来，随着自动化技术的采用和糖类合成的进步，人们对糖类的认识从具有不明确构象的分子转变为分子采用数个由低能量障碍分隔的构象，这为糖类在材料科学和超分子化学中的应用提供了新的可能性。

2024年2月5日，德国波茨坦马克斯·普朗克胶体与界面研究所的Martina Delbianco等人探讨了可编程碳水化合物结构在合成和分析方面取得的突破，这些突破使得设计人工糖类折叠聚合物和组装体成为可能，并讨论了该领域的未来前景，分析了必须克服的挑战，以建立建立碳水化合物材料按需设计规则。该综述以“Towards glycan foldamers and programmable assemblies”为题，发表在Nature Reviews Materials上。

【糖类结构的不同层次】

首先，糖类的主要结构由糖类中单糖的序列（包括糖苷键的位置和立体化学）定义。糖苷键的构象空间由立体电子学确定，而由于高能共轭（例如外异构效应和 gauche 效应）、分子内氢键和空间效应，确定了糖苷键的构象，从而定义了糖类的次级结构。水对折叠过程至关重要，因为它与分子内氢键竞争，影响相对 rotamer 的分布，使得糖类成为非常灵活的分子。然而，这种灵活性促使了广泛的误解，即这些生物分子没有明确定义的形状，并且只有在高聚合度时才会折叠成螺旋或带状结构。然而，一些糖类（如富含岩藻糖的抗原，例如Lewis X (LeX)）的情况下，多种相互作用的贡献可以生成相当刚性的几何结构。此外，糖苷键的立体电子学、l-岩藻糖的甲基基团与d-半乳糖的β面之间的疏水相互作用，以及相邻的GlcNAc基团的立体位阻进一步促使该封闭几何结构的稳定。类似的非传统氢键在其他相对刚性的糖类结构中也曾在实验证明，例如寡半乳糖。通过多种弱分子内相互作用使这些糖类片段变得刚性，可以启发设计其他折叠成定义的次级结构的人工主要基元。

此外，糖类还可以参与多种分子间相互作用，包括氢键、糖类-芳香相互作用、疏水相互作用、范德华力相互作用和与金属离子的配位，从而生成组装体和层次结构。这些相互作用指导了结晶材料（如纤维素和壳聚糖）、螺旋超结构（如卡拉胶和β-葡聚糖）以及包含复合物（如糊精-碘复合物）的形成。然而，这种多重分子间相互作用的趋势在自组装糖类寡聚体的设计中很少被重现。

在这一部分，我们审视了导致对糖类结构不同层次的更深入了解的成就。由于新的合成平台，具有明确定义组成（即主要结构）的糖类序列变得可行。这些化合物具有均匀的化学结构，可以包括标签或报告物质，使它们成为开发新的分析技术的理想探针，以探索糖类构象空间（即次级结构）和聚集倾向。

图1 | 利用糖类构建可编程体系结构的吸引特性。代表性的糖类和肽结构。通过比较可见，与肽相比，糖类可能为生成具有明确定义的三维体系结构提供引人注目且互补的特征。

【控制主要结构】

合成寡糖和多糖所需的复杂性，包括单糖的正确连接、保护基的使用、多步合成和对反应条件的严格控制。传统的合成方法耗时耗力，需要受过专业训练的科学家。然而，在过去的二十年里，出现了几种自动化技术，能够可靠地在短时间内合成寡糖和多糖。其中，自动糖类组装技术（AGA）是一种重要的方法，通过迭代进行糖基化和选择性去保护，将适当保护的单糖单元连接在固体支持上，从而获得对长度和单糖序列完全控制的目标多糖。AGA大大缩短了化学合成糖类所需的时间，特别适用于生产相关化合物的集合。此外，AGA还可以引入非经典单糖，从而方便结构分析。

然而，AGA也存在一些问题，如大量使用保护基、难以去除保护基以及技术的可扩展性。文章随后介绍了一种在2022年报道的高效自动溶液相合成器，该合成器基于预激活多组分方法进行连续乘法合成，提供了一种替代AGA的步进式延伸的方法，允许合成长达1,080个单糖单元的多糖。该合成器能够在克级规模上运行，并且通过使用化学计量的糖基构建单元，并使用在线高效液相色谱法直接监测反应的进展，克服了其他自动化平台的一些缺点。

还有一种生物合成方法，如1,6-缩酮糖的阳离子环氧聚合，提出了一种可扩展的替代方案，以生产精确的多糖。最后，文章讨论了自动酶介导的糖类合成技术，虽然仍处于初级阶段，但具有潜力克服化学合成中的保护基要求。总体而言，现在有几种技术可用于生产具有主要结构控制的精确寡糖，但在糖基化过程中对差向构象的控制，尤其是1,2-顺式键的形成，对所有自动化方法仍然是一个挑战。此外，开发具有可编程构象的糖类序列也受到适用于快速可靠分析糖类结构的合适分析技术的缺乏的限制。

图2a| 糖科学中的合成和分析改进。新的可获取的糖结构，包括长的、单分散的100-聚合物α-1,6-甘露糖苷（1）、1,080-聚合物Araf1080（2）、氟化的β-1,4-寡糖葡萄糖苷（3）和活性阳离子环氧聚合合成的化合物P(OH-l-Glc)（4）。

【理解二级结构】

核磁共振（NMR）谱学作为目前最常用的用于研究糖类在溶液中二级结构的分析技术。尽管NMR谱学提供了一系列的方法，包括二维和三维脉冲序列实验，来剖析糖类的几何结构、动态和相互作用，但在复杂的糖类结构中，吡喃糖环或呋喃糖环的1H NMR信号显示出有限的变异范围，往往重叠。这种化学位移的退化和低灵敏度使得对构象和动态分析的关键NMR参数的识别变得困难，有时甚至是不可能的。

随着铌-钛合金技术的进步，出现了能够在1 GHz及以上磁场下工作的超导磁体，结合脉冲序列实验的提速和硬件增强的信噪比，这些技术进步直接应对了NMR灵敏度和分辨率的局限性。同时，纯糖类的库也因前述的合成方法而变得可用。携带同位素标记（13C、15N、2H或19F）或镧系标签的化合物在特定位置对NMR分析尤其有用，有助于简化结构分析。这些库揭示了相对较短的寡糖（如六糖）可以采用不同构象，其中某些序列更倾向于螺旋结构，而其他序列则更倾向于棒状结构或较不明确定义的几何结构。

合成糖类探针、分子动力学模拟和NMR谱学相结合，用于深入解析一些细菌糖类的二级结构，并将其与免疫原性进行相关。这种方法被证明对于鉴定相关带电多糖的不同尺寸和手性的螺旋构象非常有效，突显了糖类构象方面的特定生物活性。尽管NMR是一种多功能且广泛可用的技术，但该技术仅适用于平均集合结果。由于糖类的几种构象通常受低能量壁垒的分隔，详细的构象信息在测量期间会被平均掉。单分子成像技术结合精密的沉积方法，如扫描隧道显微镜结合电喷雾离子束沉积（ESI–STM），能够可视化样品中所有单个糖类结构，而不是提供所有构象的集合平均。通过微调软着陆方法的碰撞能量，可以保留脆弱的气相构象或探索模型纤维素六聚体采用的整个化学空间。利用功能化的探针进一步提高了成像分辨率，使得能够可视化单个共价键。该方法的挑战在于探索溶液中的构象以及在表面上直接观察驱动糖类聚集的相互作用。

通过对明确定义的合成片段进行深入的结构分析，获得了对天然多糖结构偏好的有价值的见解。随着合成糖类集合和结构信息的获取逐渐便利，引入机器学习方法可能为糖类结构和动态行为提供前所未有的3D理解。共同项目，如Glyco3D72，连接着涵盖糖类的3D特征和有价值的NMR数据的数据库，是至关重要的，并应该通过新的分析技术产生的数据来补充。

【描述组装】

先进的传输电子显微镜技术，包括电子层析、微晶电子衍射（microED）和低温电子显微镜，拓展了电子显微镜的能力，从辐射敏感的碳水化合物组装中收集有价值的信息，提高了对其纳米尺度形态学、分散度和局部结构异质性的理解。例如，电子层析提供了未染色样本中个体颗粒的高分辨率3D信息，使用高灵敏度探测器进行低剂量成像。低温电子显微镜通过将样品嵌入玻璃状冰中，减少辐射损伤，允许在其原生状态下成像辐射敏感的糖类。

电子显微衍射和微ED提供了在纳米尺度上获取局部结构信息的途径，使分子结构能够与结晶糖类样品的外部形态相关联。此外，四维扫描透射电子显微镜（STEM）技术捕捉了STEM图中每个像素位置处的完整2D衍射图案，提供了有关材料结构和组成的数据。这些技术的应用为糖类组装提供了多个尺度上前所未有的见解，并对诱导组装或自组装过程的关键特征进行了鉴定和合理解释。

补充技术方面，扫描电子显微镜是评估大于几微米的碳水化合物组装的理想技术，因为它提供了与TEM相比更宽的视野。扫描电子显微镜用于表征从酶合成的多糖体中组装而成的木聚糖微粒，形态可以通过糖基引物的结构进行调节。此外，原子力显微镜（AFM）是电子显微镜技术的补充，对于糖类材料的成像和分析提供了强大的工具。AFM能够在液体中分析化合物，并观察其对外部刺激的结构变化。该技术的成像能力还可以与纳米级红外光谱相结合，以检测糖类组装内的局部空腔和溶剂积聚。通过AFM，还能够揭示离子结合卡拉胶多糖的分层组织，这些高度硫酸化的糖类根据离子类型和浓度经历多种离子诱导的自组装过程，形成手性超分子结构。

总体而言，这些电子显微镜和AFM研究主要对天然多糖进行了表征，这些多糖通常具有可变的尺寸分布。将这些技术应用于明确定义的寡糖组装将填补知识空白，既更好地了解天然糖类，又有助于设计人工糖类系统。通过系统地运用这些方法研究其他合成系统，我们将对糖类的复杂行为获得有价值的见解。

图2b-d| b，扫描隧道显微镜与电喷雾离子束沉积（ESI–STM）成像单个糖分子在软碰撞时的图像。c，酶合成的木聚糖微粒及其可调控形态的代表性扫描电子显微镜（SEM）图像。d，离子结合卡拉胶多糖的从一级到四级结构的分层组织和代表性原子力显微镜（AFM）高度图像。

【走向可编程糖类结构】

发现碳水化合物能够在低能垒条件下采用多个定义明确的次级结构，这表明可以实施化学策略来稳定某一构象。同样，可以精心设计寡糖链来调控糖的聚集，并实现可编程的超分子组装。在这一部分，我们重点介绍了为糖折叠体和组装体制定合理设计原则的关键里程碑。

糖折叠体：通过系统改变主要序列和使用非常规氨基酸，人们成功地获得了能够稳定折叠的短肽。受到肽折叠体丰富文献的启发，设计了一种糖折叠体，能够自发地折叠成刚性次级结构。通过连接两个天然糖结构单元，一个刚性弯曲和两个堆叠链，产生了一种糖发夹 - 一种在自然界中从未发现的几何形状。未来，通过其他单糖、糖结构单元和非常规残基的组合，可能会实现更多构象。控制糖的构象能力将有望导致可预测的功能和性质，应用于催化和纳米技术。

糖组装体：合成的糖组装体在文献中并不常见。这些例子中，糖的特定特征，如亲疏性、手性和能够进行多向氢键的能力，已被利用来引导聚集过程。通过一些糖的两性亲疏性，有时还引入非天然芳香基团，推动了从纤维到颗粒的超分子形状的组装。改变糖的立体化学（即氢氧基团的取向）可以微调导致自组装行为和合成糖肽的C−H···π相互作用。糖的固有手性也被用来在超分子组装体中从分子水平到微观水平引入不对称性。这些系统证实了立体化学、糖苷键的类型以及共价连接的糖组分的亲水性到疏水性平衡对形态的重要性。通过引入离子功能基团，可以探索通过库仑相互作用稳定折叠并通过pH改变来触发（或破坏）折叠的方法，这对于响应性糖材料是一种有用的工具。循环寡糖可能是构建基于糖的体系的有趣合成目标，能够容纳疏水客体。可用的功能化天然环糊精的方法、非常规大环的形成以及线性糖的钉扎等方法可能推动这类系统的生产。

图3 | 获取人工糖折叠体和组装体的设计原则

【展望】

科学家从自然界汲取灵感，创造了能够形成明确定义的3D结构的合成类似物。迄今为止，这些化合物主要基于肽和核酸，这些在分子水平上很好理解并且容易合成。20种氨基酸和四种核碱，再通过非经典残基扩展，使得可以生成能够采用明确定义的次级结构并组装成超分子结构的寡聚体。尽管最初这些序列受到自然界中类似物的启发（如胶原蛋白和淀粉样蛋白），但该领域已经发展到可以通过计算程序辅助设计完全人工结构的程度。

我们相信碳水化合物的潜力远未充分发挥。超过100种单糖的选择，可以通过非经典残基进行扩展，为结构设计提供了几乎无限的可能性。技术进步已经使得能够合成大量受序列控制的长链糖，新的关于糖结构的认识表明，糖可以被编程以创建可折叠和可调形状的折叠体和材料。该领域仍处于初级阶段，需要更多的化学反应、建模技术和结构数据来建立可靠的设计原则。最终，合成、建模和分析之间的强烈协同作用应该提供一个工具箱，用于按需生产糖类结构。

目前大多数分析技术都是静态的，只能提供对最多态的信息。将单分子分析技术扩展到研究更多的糖类将是糖类研究领域的一个重要里程碑，揭示出否则看不到的构象。通过快速冷冻糖样品，可以用NMR谱学来捕捉非平衡的瞬态状态，并在过去的蛋白变性研究中展示了对低占用构象的洞察。标记的糖是提高糖NMR信号的关键。将常用于复杂生物材料表征的分析方法，如小角X射线散射和聚焦离子束扫描电子显微镜，应用于合成糖类组装体的分析，这些方法可以在数十纳米的分辨率下分析结晶糖类组装体的大小分布、形状、方向和结构。表面红外和扫描探针显微镜可以用于表征表面性质，如化学结构、亲水性或疏水性，以及人工糖类系统中离子基团的位置。

公开可用的神经网络平台，包括RoseTTAFold和AlphaFold2，已经显示出人工智能体系结构可以将1D、2D和3D信息相互连接，使网络能够集体推断蛋白质的化学和折叠结构之间的关系。我们设想类似的基于人工智能的网络将出现在糖类中，能够根据大小和形状的个体需求提出糖化学序列的建议。

类似于发现基于肽的折叠体如何开创了一个新领域，我们预期糖折叠体和组装体可能在材料科学、生物学和催化等领域找到应用。精确的寡糖已经被探索用于构建具有可控表面和尺寸的纳米材料。糖折叠体可以启发设计新型的糖类仿生药物，提高其对酶降解的稳定性和/或最小化与目标蛋白结合的熵惩罚。我们设想还可以将其用于化学传感器、酶催化转化的催化剂和生物基质模拟体的模拟。这些应用很大程度上受到肽领域的启发，但随着对糖折叠体和组装体设计的认识增加，可能会揭示更多的机会。最后，糖折叠体和组装体的设计是增加我们对碳水化合物结构及其与自然界中其他分子相互作用的理解的引人挑战。这一领域的进展将推动合成和分析化学的界限。

图4 | 糖折叠体和组装体的未来展望

https://doi.org/10.1038/s41578-023-00638-x

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