果蝇Mre11蛋白精氨酸甲基化位点检测及相关突变果蝇构建

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作者：

袁卿

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摘要：

MREll是MRE11/RAD50/NBN蛋白复合物(MRN复合物)的主要成分之一.MRN复合物进化上高度保守,在DNA损伤的识别,信号传导以及下游修复等过程中行使重要的功能.MREll蛋白具有核酸酶的活性,可以对DNA断裂末端进行切割处理,在MRN复合物的结构和功能中处于核心地位.当人类的Mre11基因发生突变时,会导致共济失调性毛细血管扩张症样紊乱综合症(ATLD).如果存在外源损伤因素,Mre11基因突变会导致癌症发生,目前已经发现Mre11基因突变发生于多种肿瘤中.在小鼠实验中,Mre11基因缺失会引起小鼠胚胎致死.因此,研究MRE11在DNA损伤修复过程中的的功能调控对于相关疾病的预防及治疗至关重要.大量的研究结果表明,翻译后修饰对于核酸结合蛋白的功能具有重要的调节作用.近期的研究发现,MRE11的C端含有一个甘氨酸-精氨酸富集区(Glycine-Arginine rich domain),可以被甲基转移酶PRMT1介导发生精氨酸甲基化修饰,并且这种修饰参与调节MRE11在DNA损伤修复中的各种功能.但是,到目前为止尚未见到在动物体水平研究Mre11精氨酸甲基化调控的相关报道,由于Mre11基因缺失会导致小鼠胚胎死于发育早期,所以,以小鼠作为模型研究Mre11基因的功能受到了很大的限制.这就迫切需要建立一种其它较高等的真核生物模型,用来在动物整体水平研究Mre11基因的功能和调节.秘晓林实验室的前期结果表明,Mre11基因缺失的果蝇会死于成蛹阶段的晚期,使其成蛹前的幼虫成为理想的动物模型.为了验证果蝇作为精氨酸甲基化研究模型的可行性并构建相关突变果蝇,我们首先通过体外蛋白纯化,得到果蝇中的甲基转移酶DAR11和靶蛋白MRE11及其N端,C端和中间区域3个分段,并通过同位素标记在体外甲基化反应中检测到MRE11的甲基化修饰;然后,使用clustalw2和align软件进行同源比对,表明果蝇中的MRE11在结构上高度保守,同样在C端包含了GAR结构域;再通过甲基化位点预测软件MeMo,分析了果蝇的MRE11序列,结果共预测出7个精氨酸甲基化位点,其中有6个处于GAR区,分别为R559,R563,R565,R569,R571和R579.我们针对以上6个处于GAR区的预测位点,分别制备了位点特异的甲基化抗体,通过蛋白免疫印迹已经检测到果蝇0-4h胚胎中的2个甲基化位点,分别为R565和R571;同时,我们成功构建了用于Mrell基因敲除的转基因果蝇,通过Targeting步骤,得到了潜在的原位插入attP重组位点的基因敲除果蝇并成功构建了甲基化预测位点精氨酸到丙氨酸的突变载体,该载体带有attB重组位点,可以用来建立甲基化位点特异的基因突变果蝇,为在动物体水平研究MRE11精氨酸甲基化的功能提供理想的模型.通过这个模型,我们可以更加深入的研究MRE11蛋白翻译后修饰,特别是甲基化修饰对其功能的调节模式,为人类相关疾病的预防和治疗提供新的靶点和策略.

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关键词：

DNA损伤修复 Mre11 精氨酸甲基化 基因敲除 原位点突变