基于磁珠法从植物叶片中提取基因组dna的试剂盒及其提取方法

发明内容 本发明的目的是要提供一种可以适用于棉花，葡萄，黑加仑等植物的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒及其提取方法。根据本发明的一个方面，提供的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒，其包括预处理溶液，快速裂解液，DNA结合液、磁珠悬浮液和洗脱液，预处理溶液0. 05M 0. 2M Tris-HcUO. 01 0. 05M EDTA (乙二胺四乙酸)、体积比为I % 3 %的巯基乙醇、质量/体积比为0. 5 % 2 %的PVP (聚乙烯吡咯烷酮)，快速裂解液50 100mmol/L KAC(醋酸钾)，PH = 5. 2、10 50mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)、4 6M GHCL(盐酸狐)、5 25mM sodium citrate (朽1樣酸纳)、I 5%Tween 20 (聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯)，DNA结合液质量/体积比为5 % 10 %的PEGS000(聚乙二醇8000)、1. 5-4MGITC (异硫氰酸胍)，0. 5-1M NaCl，磁珠悬浮液磁珠溶于超纯水中，其中磁珠的浓度为50-100mg/mL,洗脱液1 IOmM Tris-HCl、l-2mM EDTA (乙二胺四乙酸)，pH = 8.0。 其有益效果是，预处理溶液可以有效的破解细胞壁和细胞膜，但是不能破坏细胞核，由于基因组DNA位于细胞核内，而多糖、多酚、单宁等则存在于细胞质中，由于多糖、多酚、单宁会溶于预处理溶液内，所以通过预处理溶液可以有效的去除多糖、多酚、单宁等杂质对于基因组DNA提取的干扰裂解液以盐酸胍和Tween 20为主要成分，常温条件下能够在2min内充分裂解植物细胞，并且后续的离心步骤只要2min即可，大大节约了操作时间。盐酸胍为强变性剂，其裂解细胞的效果远好于CTAB和SDS。采用2倍体积的5% PEG, 4M GITC和0. 5M NaCl溶液代替无水乙醇作为DNA结合 液，效果更好，得率更高。而且，本发明采用的技术方案当中，不需要加入有机溶剂氯仿等，不会对操作人员 产生危害，安全可靠。在一些实施方式中，磁珠的颗粒直径为100-200nm,磁珠表面包被娃轻基。其有益效果是，通过磁珠对基因组DNA产生吸附作用，从而实现对基因组DNA的提取操作，由于纳米级别的磁珠外表面为一层二氧化硅，由于磁珠颗粒小，比表面积大，磁珠法的得率一般都要高于硅胶柱式法，更为重要的是，磁珠方更容易实行自动化和高通量。根据本发明的另一方面，提供的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒的提取方法，其包括步骤一、取植物叶片放于研钵内研磨充分，研磨时间为l_2min ；步骤二、若所取植物叶片为棉花，黑加仑，草莓，葡萄等多糖、多酚、单宁、脂质含量丰富类的植物叶片，加入500 u L预处理液，若所取植物为水稻，小麦或者玉米类简单植物叶片，则直接进入步骤三；步骤三、加入500 U L快速裂解液；步骤四、在8，000-12, OOOrpm 下离心 l_3min ；步骤五、小心吸取400 U L上清至一新的2mL离心管中，避免吸起沉淀，加入混合液400-1000 u L DNA结合液和10-50 u L磁珠悬浮液，充分涡旋混匀；步骤六、在18-25°C下静置5-10min后，将离心管置于磁力架上，静置l_3min ；步骤七、吸去上清，加入体积比为70%的乙醇，将离心管从磁力架上取下，充分涡旋混匀后静置l_3min，再将离心管置于磁力架上；步骤八、将离心管置于磁力架上风干5_15min ；步骤九、加入100-150 ii L预热65°C的DNA结合液，将离心管从磁力架上取下，充分涡旋混匀，并在55-80°C水中水浴2-8min ；步骤十、将离心管置于磁力架上，静置l_2min ；步骤^^一、小心将上清吸出，备用。其有益效果是，本发明的提取方法尤其适用于棉花，葡萄，黑加仑这些多糖、多酚、单宁、脂质等次生代谢物含量丰富的植物叶片组织的基因组DNA提取。在一些实施方式中，在步骤一中，若所取植物叶片为新鲜植物叶，则取量不超过lOOmg，若所取植物叶片为干燥组织，则取量不超过50mg，。其有益效果是，因为新鲜植物叶中含水份较多，所以取量稍大些，而干燥组织的含水量较少，所以取量可以稍小些。在一些实施方式中，在步骤一中，在研钵内加入液氮后再进行研磨。其有益效果是，利用液氮创造一个低温环境，一方面，低温可以抑制核酸酶的活性，使得基因组DNA免受核酸酶的侵袭，另一方面，低温可以使物体的脆性增强，从而更便于研磨，而且研磨时也更省力。在一些实施方式中，在步骤七与步骤八之间还包括一步骤，吸去上清，加入体积比为70%乙醇，将离心管从磁力架上取下，充分涡旋混匀后静置l_3min，再将离心管置于磁力架上。其有益效果是，通过两次同样的重复操作，使得提取的基因组DNA的纯度更加的闻。

图I是本发明的试剂盒及其提取方法提取的基因组DNA的琼脂糖电泳对比图；其中M道为标记泳道，1,2泳道为实验1-1中CTAB方法提取的棉花新鲜嫩叶基因组DNA条带，3，4泳道为实验1-1中采用本发明提取的棉花新鲜嫩叶基因组DNA条带，5，6泳道为实验1-2中CTAB方法提取的棉花老叶基因组DNA条带，7，8泳道为实验1_2中采用本发明提取的棉花老叶基因组DNA条带。图2是本发明的试剂盒及其提取方法提取的基因组DNA的又一琼脂糖电泳对比图；其中，1，2泳道为实验2中采用CTAB方法提取的水稻叶片基因组DNA条带；3，4泳道为实验2中采用本发明提取的水稻叶片基因组DNA条带。 具体实施例方式下面结合具体的实施例来进一步的阐述本发明，应当理解，这些实施例仅用于解释说明本发明，可以有不同形式的等效替换，本实施例不能限制本发明的保护范围。I、试剂盒一种基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒，其包括预处理溶液，快速裂解液，DNA结合液、磁珠悬浮液和洗脱液，预处理溶液包括0. 2M tris-HCL、0. 05M EDTA、体积比为2%的巯基乙醇和质量/体积比为2%的PVP，快速裂解液包括100mmol/LKAC, PH = 5. 2、50mmol/L EDTA、6MGHCl、5mM sodiumcitrate^2% Tween 20,DNA 结合液包括5% PEG8000、4M GITC，0. 5M NaCl,磁珠悬浮液包括磁珠溶于超纯水中，其中磁珠的浓度为50mg/mL，磁珠的颗粒直径为100-200nm，磁珠表面包被硅羟基，洗脱液包括5mMTris-HClUM EDTA, pH = 8. O其中tris-HCL采用加拿大生物技术公司(BBI)的BB0079，EDTA采用美国西格玛公司(Sigma)的E6758，PVP采用加拿大生物技术公司(BBI)的#PB0436，KAC采用加拿大生物技术公司(BBI)的PB0438，GHCL采用美国西格玛公司(Sigma)的#G3272，sodiumcitrate采用美国西格玛公司(Sigma)的#C8532, Tween 20采用美国西格玛公司(Sigma)的# 9416沖￡68000采用加拿大生物技术公司(BBI)的#PB0433，GITC采用美国西格玛公司(Sigma)的#69277，似(1采用加拿大生物技术公司(BBI)的ST1218。2、基因组DNA提取方法采用该试剂盒从植物当中提取基因组DNA的方法，其步骤包括步骤一、取植物叶片放于研钵内，并加入液氮研磨充分，研磨时间为2min ； 步骤二、若所取植物叶片为棉花，黑加仑，草莓，葡萄等多糖、多酚、单宁、脂质含量丰富类的植物叶片，加入500 U L预处理液，若所取植物为水稻，小麦或者玉米类简单植物叶片，则直接进入步骤三； 步骤三、加入500 U L快速裂解液；步骤四、在12，OOOrpm下离心2min ；步骤五、小心吸取400 u L上清至一新的2mL离心管中，在吸取的时候避免吸起沉淀，加入混合液800 u L DNA结合液和20 ii L磁珠悬浮液，充分涡旋混匀；步骤六、在20°C下静置5min后，将离心管置于磁力架上，静置Imin ；步骤七、吸去上清，加入70%乙醇，将离心管从磁力架上取下，充分涡旋混匀后静置lmin,再将离心管置于磁力架上；步骤八、重复步骤七的全部操作一次步骤九、将离心管置于磁力架上风干IOmin ；步骤十、加入150 预热65°C的DNA洗脱液，将离心管从磁力架上取下，充分涡旋混匀，并在65 °C水中水浴5min ；步骤^^一、将离心管置于磁力架上，静置2min ；步骤十二、小心将上清吸出，备用。3、结果对比分析将本发明技术方案的实验结果与现有技术的CTAB方法的实验结果进行对比分析。实验1-1选用IOOmg棉花新鲜嫩叶进行基因组DNA的提取。同时采用本发明的提取方法与现有技术的CTAB方法同时进行。最后均用150 ii L洗脱液实验结果的数据对比如表所示 权利要求 1.基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒，其包括预处理溶液，快速裂解液，DNA结合液、磁珠悬浮液和洗脱液，预处理溶液0. 05M 0. 2M Tris-Hcl、0. 01 0. 05M EDTA (乙二胺四乙酸)、I % 3%巯基乙醇、0. 5% 2% PVP(聚乙烯吡咯烷酮)， 快速裂解液50 100mmol/L KAC (醋酸钾)，PH = 5. 2、10 50mmol/LEDTA (乙二胺四乙酸)、4 6M GHCL (盐酸狐)、5 25mM sodium citrate (朽1 樣酸纳)、I 5% Tween20 (聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯)， DNA 结合液5% 10%PEG8000(聚乙二醇 8000)、1. 5-4M GITC (异硫氰酸胍)，0. 5-1MNaCl, 磁珠悬浮液磁珠溶于超纯水中，其中磁珠的浓度为50-100mg/mL, 洗脱液1 IOmM Tris-HCl、l-2mM EDTA(乙二胺四乙酸)，pH = 8. O。 2.根据权利要求I所述的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒，其中，磁珠的颗粒直径为100-200nm，磁珠表面包被硅羟基。 3.权利要求I或2所述的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒的提取方法，其包括 步骤一、取植物叶片放于研钵内研磨充分，研磨时间为l_2min ； 步骤二、若所取植物叶片为多糖、多酚、单宁、脂质含量丰富类的植物叶片，加入500 u L预处理液，若所取植物为水稻，小麦或者玉米类简单植物叶片，则直接进入步骤三； 步骤三、加入500 u L快速裂解液； 步骤四、在 8, 000-12, OOOrpm 下离心 l_3min ； 步骤五、小心吸取400 u L上清至一新的2mL离心管中，避免吸起沉淀，加入混合液400-1000 u L DNA结合液和10-50 u L磁珠悬浮液，充分涡旋混匀； 步骤六、在18-25°C下静置5-10min后，将离心管置于磁力架上，静置l_3min ； 步骤七、吸去上清，加入体积比为70%的乙醇，将离心管从磁力架上取下，充分涡旋混勻后静置l-3min,再将尚心管置于磁力架上； 步骤八、将离心管置于磁力架上风干5-15min ； 步骤九、加入100-150 ii L预热65°C的DNA结合液，将离心管从磁力架上取下，充分涡旋混匀，并在55-80°C水中水浴2-8min ； 步骤十、将离心管置于磁力架上，静置l_2min ； 步骤十一、小心将上清吸出，备用。 4.根据权利要求3所述的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的提取方法，其中步骤一中， 若所取植物叶片为新鲜植物叶，则取量不超过lOOmg， 若所取植物叶片为干燥组织，则取量不超过50mg。 5.根据权利要求4所述的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的提取方法，其中，步骤一中，在研钵内加入液氮后再进行研磨。 6.根据权利要求3或4或5所述的基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的提取方法，其中，步骤七与步骤八之间还包括一步骤，吸去上清，加入体积比为70%的乙醇，将离心管从磁力架上取下，充分涡旋混匀后静置l_3min，再将离心管置于磁力架上。 全文摘要 本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒及其提取方法，基于磁珠法从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒，其包括预处理溶液，快速裂解液，DNA结合液、磁珠悬浮液和洗脱液，通过预处理溶液可以有效的破解细胞壁和细胞膜，通过预处理溶液可以有效的去除多糖、多酚、单宁等杂质对于基因组DNA提取的干扰。快速裂解液以盐酸胍和Tween 20为主要成分，常温条件下能够在2min内充分裂解植物细胞，并且后续的离心步骤只要2min即可，大大节约了操作时间。盐酸胍为强变性剂，其裂解细胞的效果好，而且，本发明中不需要加入有机溶剂氯仿等，不会对操作人员产生危害，安全可靠。 文档编号C12N15/10GK102618532SQ20121013132 公开日2012年8月1日 申请日期2012年5月2日 优先权日2012年5月2日 发明者李宗飞 申请人:姬云, 易春, 李凯, 李宗飞