FSHW

用微信扫码二维码

分享至好友和朋友圈

Introduction

食品蛋白质的酶水解正在成为食品和制药工业的一种选择方法。来源于蛋白质水解的多肽可用于开发具有抗氧化、降压、抗菌等改善生物功能的营养食品或功能性食品。乳清是奶酪生产的副产品，乳清蛋白因其具有较高的营养价值和一级结构中活性肽的含量而受到广泛的关注。牛乳清中含有20%的乳蛋白，约5%全乳乳糖，还有微量脂肪（0.1%）和矿物质盐（0.46%～10%）。牛乳清蛋白主要为β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，还含有一定量的牛血清白蛋白（BSA）、牛乳铁蛋白（BLF）、免疫球蛋白、乳过氧化物酶、蛋白质糖巨肽。目前，乳清奶酪作为乳制品生产中的副产品被丢弃，但可以通过加工以获得新的食品。

用于食品源性生物活性肽的分析方法主要有酶法和微生物体外法，液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术被广泛用于肽测序的不同应用，包括蛋白质的酶水解。蛋白质水解物中数百种肽功能的实验表征和验证非常耗时，需要昂贵的实验装置。因此，可以开发计算预测方法，以基于数据库中存储的先前知识来执行大规模功能预测，从而对来自肽组分析的肽序列进行优先级排序。

如果样品中存在生物活性肽，则可直接使用公开数据库中报告的生物活性肽来推断有关食品中蛋白质组的预测，然而，在新的蛋白质源中识别的大多数肽不会被存储在知识数据库中。因此，肽功能预测需要使用更多基于机器学习模型的间接技术来执行，该模型除了能够预测新的候选生物活性肽外，还可以提供肽特性与其生物学功能之间关系的见解。在主要的生物功能中，由于抗氧化肽通过不同的机制同时发挥作用，食品蛋白水解物的抗氧化特性在食品领域具有广泛的应用前景。

哥伦比亚安第斯大学的Jesus Morales García、Andrés Fernando González Barrios*等 在本研究中，通过LC-MS/MS对两种酶在不同水解条件下水解的乳清肽进行鉴定，以确定其抗氧化性能及其肽谱。使用集成机器学习模型推断已测序肽的抗氧化能力，并对有希望的肽进行优先排序，以进一步验证抗氧化能力。

Results and Discussion

乳清蛋白水解物的体外抗氧化分析

通过测定ABTS+阳离子和Fe2+螯合来测定乳清蛋白水解物的抗氧化能力。ABTS+自由基的清除能力取决于抗氧化剂通过与过硫酸钾氧化产生的脱色作用来清除ABTS+自由基阳离子，并通过与氢供体分子的相互作用来还原。过渡金属离子Fe2+可以催化活性氧自由基的形成及促进脂质的过氧化作用，而对细胞和组织造成损伤，如果将这些金属离子耦合即可消除其催化作用，提高抗氧化活性。在这两种情况下，所有的乳清水解都表现出ABTS+自由基清除和Fe2+螯合能力。图1A显示，与使用风味酶产生的水解产物相比，碱性蛋白酶水解产物在清除ABTS方面最有效。以往利用不同蛋白酶（在其最适pH和温度下）进行乳清蛋白水解的研究报道了用碱性蛋白酶水解乳清蛋白的抗氧化能力最高。如图1B所示，乳清水解产物具有Fe2+螯合能力，但碱性蛋白酶和风味酶产生的样品之间存在显著差异。

图1 乳清水解物的抗氧化性能（紫色：碱性蛋白酶的水解物，绿色：风味酶的水解物）

接下来，从每种酶中选择3个处理组进行肽组学分析，包括抗氧化能力最高和最低的样品。

三种不同条件下乳清水解产物的肽组学研究

结合高效液相色谱和质谱分析，对碱性蛋白酶和风味酶的12个乳清水解产物进行了多肽序列分析。在不同的作用时间、温度、pH条件下进行重复试验，共鉴定了2572条肽序列。其中，如表1所示，乳清水解物中的大部分肽来自β-乳球蛋白，其次是β-酪蛋白和α-乳清蛋白。

表1 在乳清水解物中鉴定的蛋白质和从每种蛋白质中提取的肽的数量

图2显示了水解产物中鉴定的肽的总数和在每个水解产物的两次重复实验中检测到的肽的数量。

图2 在每种酶和工艺条件下，通过LC-MS/MS在乳清水解物中鉴定的肽总数（浅蓝色）；在两次重复实验中检测到的肽的数量（深蓝色）

对各水解物中的肽段进行主成分分析，发现各水解物中肽段的重复和酶之间的差异具有重复性（图3）。进一步，基于前2个主成分的PCA得分图可以清晰地分离各酶的水解条件。这些发现对于验证蛋白酶在不同生产批次中释放相关肽的特异性非常重要。

图3 使用肽数据的乳清水解物的PCA评分图

机器学习方法对乳清水解液中抗氧化肽预测的性能

本项工作的主要集中在与增强乳清水解物抗氧化性能相关的肽上，因此，从BIOPEP-UWM中构建训练集作为阳性数据集，从LC-MS/MS识别的肽中随机选择相同大小的训练集作为阴性数据集，以获得平衡的数据集。针对抗氧化肽和序列肽提取与CTD相关的肽特征，并在此数据集上训练不同的机器学习算法，以预测序列肽的抗氧化能力。如表2所示，单分类器的预测精度在0.730～0.772之间，表明对抗氧化肽有很好的预测作用。集成分类器的预测性能在不同分类器中最高，准确率为0.787，AUC为0.871。

表2 机器学习算法和集成分类器的预测性能

图4展示了100个评估分类中每个分类器具有最高AUC的分类器的ROC曲线。

图4 单个分类器和集成分类器的ROC曲线

应用集成分类器对乳清水解物中的多肽进行分类

考虑到不同分类器的预测性能最高，采用集成模型（LR＋KN＋SVM＋RF）结合各分类器的预测对乳清水解物中的肽进行分类。

在100次迭代中，只有至少51次从乳清水解物中预测为抗氧化剂的肽被指定为抗氧化肽，其余被指定为非抗氧化肽。为了区分乳清水解产物多肽学分析中预测的抗氧化肽，选择三个不同条件下两个重复中检测到的多肽进行比较分析。从图5可以看出，碱性蛋白酶水解的乳清蛋白比风味酶水解的乳清蛋白具有更高的抗氧化肽比例，这与体外抗氧化分析一致，碱性蛋白酶水解的乳清蛋白比风味酶水解的乳清蛋白具有更高的体外TEAC和金属螯合能力。此外，在pH 8.5的条件下产生抗氧化能力最强的水解产物是含有抗氧化肽比例最高的水解产物。

图5 每种处理乳清水解物中预测为抗氧化剂的抗氧化肽的比例

抗氧化肽的图形分布如图6中的Venn图所示，用同一种酶产生的乳清水解物分别占碱性蛋白酶和风味酶预测抗氧化肽的11%和18%。在pH值为5.5时，预测为抗氧化剂的独特肽的数量最高。其中，碱性蛋白酶和风味酶的抗氧化能力最低，分别为61和46个肽。LC-MS/MS未鉴定出的5个氨基酸以下的肽大小可能限制了抗氧化能力较高的条件下肽的数量，因为据报道短肽长度具有抗氧化能力。尽管如此，在pH 5.5时，碱性蛋白酶中被列为抗氧化剂的肽的比例较低，因为在此条件下，与其他条件有关的肽数量较多。

图6 乳清水解物的每种条件下预测为抗氧化剂的肽数量Venn图

为了比较乳清水解物中检测到的肽的长度与已知抗氧化肽的长度，对来自BIOPEP-UWM的抗氧化肽、乳清水解物中鉴定的肽以及分类为抗氧化剂的鉴定肽进行了长度分布统计。结果如图7所示，来自BIOPEP-UWM的抗氧化肽的长度呈负指数分布，具有较短链长的肽的数量较多。乳清水解物中鉴定的肽往往具有链长的正态分布，在11个氨基酸残基的肽中观察到的频率最高。相反，被归类为抗氧化剂的肽倾向于具有不对称正态分布，向较短链长度倾斜。虽然肽长度未被纳入分类中，且所有特征均通过肽长度标准化，但很明显，分类改变了被分类为抗氧化酶的乳清肽的肽链长度分布。

图7 BIOPEP-UWM抗氧化肽中肽长度的分布及乳清水解物中的抗氧化肽

Conclusion

本研究首次报道了不同工艺条件下乳清水解产物的肽谱。接下来对使用两种商业酶和三种加工条件生产的乳清水解产物进行多肽学分析，主成分分析区分不同的加工条件和酶。为了识别乳清水解物中的抗氧化肽，使用四种学习算法提出了一种集成学习分类器。集成学习分类器能够有效预测乳清水解物中的抗氧化肽。较高比例的肽被归类为抗氧化剂，这与酶和加工条件方面具有最高抗氧化能力的水解物相一致。准确鉴定抗氧化肽不仅可以提供新的已报道的抗氧化肽，而且有助于研究肽特性与其生物学功能之间的关系。

Peptidomic analysis of whey protein hydrolysates and prediction of their antioxidant peptides

Jesus Morales Garcíaa, Chibuike C. Udenigweb, Jorge Duitamac, Andrés Fernando González Barriosa,*

a Grupo de Diseño de Productos y Procesos (GDPP), Department of Chemical and Food Engineering, Universidad de los Andes, Bogotá 111711, Colombia

b School of Nutrition Sciences, University of Ottawa, Ottawa, Ontario, K1N 6N5, Canada

c Systems and Computing Engineering Department, Universidad de Los Andes, Bogotá 111711, Colombia

*Corresponding author.

E-mail address: [email protected]

Abstract

Enzymatic hydrolysis of proteins is a breakdown process of peptide bond in proteins, releasing some peptides with potential biological functions. Previous studies on enzymatic hydrolysis of whey proteins have not identified the complete peptide profiles after hydrolysis. In this study, we reconstructed a profile of peptides from whey hydrolysates with two enzymes and different processing conditions. We also developed an ensemble machine learning predictor to classify peptides obtained from whey hydrolysis. A total of 2572 peptides were identified over three process conditions with two enzymes in duplicate. 499 peptides were classified and chosen as potential antioxidant peptides from whey proteins. The peptides classified as antioxidants in the hydrolysates had a proportion of 13.1%–24.5% regarding all peptides identified. These results facilitate the selection of promising peptides involved in the antioxidant properties during the enzymatic hydrolysis of whey proteins, aiding the discovery of novel antioxidant peptides.

Reference:

GARCÍA J M, UDENIGWE C C, DUITAMA J, et al. Peptidomic analysis of whey protein hydrolysates and prediction of their antioxidant peptides[J]. Food Science and Human Wellness, 2022, 11(2): 349-355. DOI:10.1016/j.fshw.2021.11.011.

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意

为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社在宁波和西宁成功召开前两届“动物源食品科学与人类健康国际研讨会”的基础上，将与郑州轻工业大学、河南农业大学、河南工业大学、河南科技学院、许昌学院于2022年5月7-8日在河南郑州共同举办“2022年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。欢迎相关专家、学者、企业家参加此次国际研讨会。

特别声明：以上内容(如有图片或视频亦包括在内)为自媒体平台“网易号”用户上传并发布，本平台仅提供信息存储服务。

Notice: The content above (including the pictures and videos if any) is uploaded and posted by a user of NetEase Hao, which is a social media platform and only provides information storage services.