病原性丝状真菌快速诊断和鉴定的实验研究

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作者：

张晓利

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摘要：

第一部分丝状真菌DNA提取方法的比较和优化 目的筛选适合提取丝状真菌模板DNA的方法.方法比较2个菌落培养时间段(3d内和7-14d)提取DNA质量的差异;运用氯化苄法,CTAB法,Biospin法和微波法分别提取黑曲霉基因组DNA,后用直接电泳,浓度测定,PCR扩增等方法比较所提DNA的浓度和质量;选出最优方法,用8种常见丝状真菌进行检验和验证.结果培养3天内的菌落提取的DNA纯度较高,无需纯化即可用于后续实验;4种方法制备的DNA均可用于PCR等后续实验,其中以CTAB法提取的DNA纯度好,产率最高.结论CTAB法是一种适用于丝状真菌DNA提取的简便方法. 第二部分PCR-RFLP技术快速鉴别8种致病丝状真菌病原菌的实验研究目的建立能应用于临床检测深部丝状真菌感染病原菌的PCR-RFLP方法.方法用真菌通用引物扩增烟曲霉,黄曲霉,土曲霉,黑曲霉,杂色曲霉,构巢曲霉,尖端赛多孢和串珠镰刀菌的ITS区,分别用HhaⅠ,HaeⅢ,HinfⅠ,TaqⅠ和MspⅠ5种限制性核酸内切酶对PCR产物进行酶切,建立以PCR为基础的RFLP方法,然后对22株临床株和2株环境分离株进行PCR-RFLP图谱分析.结果对PCR产物进行RFLP分析可以准确鉴定8种深部致病丝状真菌,从DNA提取到酶切分析可以在一个工作日中完成;22株临床株和2株环境分离株PCR-RFLP鉴定结果与传统的形态学鉴定结果一致.结论PCR-RFLP技术是一种能够快速鉴定深部感染丝状真菌的有效方法. 第三部分多重PCR检测深部曲霉感染病原菌的实验研究 目的建立能同时鉴别多种曲霉病原菌的多重PCR体系.方法筛选4种最常见深部曲霉感染病原菌(烟曲霉,黄曲霉,土曲霉和黑曲霉)的特异性引物建立多重PCR体系,用该体系检测4种曲霉单模板,双模板和三模板的扩增情况,用DNA模板连续稀释的方式检测该反应体系的敏感性.然后对22株临床株和2株环境分离株进行检测.结果该多重PCR体系有较好的特异性,4种曲霉分别扩增出250 bp,200bp,450 bp和150 bp的DNA片段,电泳图中能够很好区别;在合适的反应条件下,对单模板,双模板和三模板均能扩增出目的片段,未见明显非特异片段的干扰;多重PCR体系的敏感性为100pg,较单种特异性引物的敏感性(10pg)略差.结论多重PCR体系能够检测4种曲霉的单纯感染和混合感染,是一种快速,敏感,特异性强的诊断方法. 第四部分菌落PCR快速鉴别丝状真菌的实验研究 目的探讨菌落PCR在检测丝状真菌病原菌方面的运用.方法初步建立丝状真菌菌落PCR的检测技术,用19种丝状真菌标准株进行验证,选取部分菌种的菌落PCR产物和酶切结果与常规PCR产物和酶切结果进行比较;所有菌落PCR产物进行测序,检测其准确性.结果19株菌中有16株(占84.2%)菌落PCR扩增成功;其中有7株菌进行了菌落PCR与常规PCR产物及酶切图谱的比较,结果条带完全一致;16株扩增成功的菌株ITS区测序结果与传统形态学结果一致.结论菌落PCR可以用于丝状真菌的快速检测,不仅缩短了菌落形态学鉴定所需的较长时间,而且也节省了制备模板DNA的时间和成本,是一种快速,经济的PCR检测技术. 第五部分菌落PCR快速鉴定菌种的临床应用 目的探讨菌落PCR在临床标本检测中的应用.方法收集1例皮下真菌感染的临床标本,在真菌培养长出菌落伊始即进行菌落PCR检测,扩增ITS区进行测序,鉴定病原菌的菌种;收集浅部真菌感染的临床标本(指趾甲,皮屑)11例,选择真菌通用引物NS,皮肤癣菌特异性引物和酵母菌特异性引物组成的多重PCR体系,用菌落PCR的方法进行扩增后,根据扩增片段大小判断病原菌的种属.结果菌落PCR鉴定皮下真菌感染病例的病原菌在取材后的第4天完成,鉴定菌种与传统形态学方法鉴定结果一致;菌落PCR鉴定浅部真菌感染病原菌在3-5d内完成,能将病原菌初步鉴定至种属水平,较传统形态学鉴定节省10d左右的时间.结论菌落PCR技术检测临床标本快速简便,适合临床实验室常规使用.

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关键词：

丝状真菌 DNA提取 PCR-RFLP 多重PCR 菌落PCR

被引量：

2

年份：

2010