宏基因组二代测序技术临床应用中假阳性及假阴性发生原因与防范措施

欧蒙医学诊断（中国）有限公司学术部  供稿

宏基因组二代测序技术（mNGS）是一项无偏倚的病原学诊断方法，可检测到样本中包括宿主和病原微生物核酸的任何核酸信息。因此，mNGS在临床应用中带给临床医生更多的诊断信息，同时也给医生带来一些疑惑，比如有些检测报告提示多种病原体，这导致临床很难甄别真正的致病原；而有些患者临床上明显存在感染征象，但mNGS检测结果却是阴性。那么，导致假阳性和假阴性的原因都有哪些，又该如何避免mNGS假阳性和假阴性的发生呢？本文就相关问题予以论述，同给出控制措施。

mNGS假阳性发生的原因

1.样本采集或运输流程中引入的微生物或核酸：如经皮穿刺，即使严格遵循无菌操作，皮肤表面或周围环境已死亡的微生物及其核酸，仍有可能在采集过程中被引入，如表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、棒状杆菌属及不动杆菌属等。

2.正常人体定植微生物：微生物群落栖息在人体的各个部位，包括呼吸道粘膜、皮肤以及肠道等，这些菌群在维持人类健康方面发挥着重要作用。目前研究发现，健康人肺内也存在着连续多样的菌群生态系统。此外，mNGS揭示了健康人外周血中也可能存在微生物核酸序列，这颠覆了人们原有的认知。

3.检测流程中的背景微生物：mNGS常检出较多背景微生物，包括试剂工程背景菌、环境微生物及实验室残留微生物。已有研究报道，背景微生物受所有实验室流程（包括样品预处理、核酸提取和文库制备）的影响，既可以来源于通用流程，也可来源于各实验室的特有流程。高水平的背景微生物并不代表检测性能差，可通过有效的数据过滤方式降低背景微生物所导致的假阳性结果。

背景微生物受文库制备和核酸提取方法的影响（a）以及构建数据过滤器降低FP结果（b）

4.样本间的交叉污染：样本间的交叉污染表示含有高丰度病原体的样本，交叉污染到其他样本，从而产生假阳性结果。样本的采集、运输、处理和实验过程中均有可能产生样本间的交叉污染。对于mNGS，交叉污染还可能是测序仪在混合测序时，对于高频标签（index）可能产生错误分配，导致标签跳跃（Index hopping）而引起。

5.错误种属鉴定：微生物的分类依赖于参考数据库，使用非精密的数据库进行序列比对时，容易产生假阳性结果。在一些革兰氏阴性菌中的可移动元件，包括质粒、噬菌体、转座子、基因岛等，也会影响物种的鉴定。研究者对参考数据库序列来源的评估发现，使用NT数据库时，产生了多个虚假分类，导致较高的假阳性率和假阴性率。

此外，属内物种或种间相似性过高，数据库比对时，容易造成错分。如肺炎链球菌、假肺炎链球菌、大肠埃希菌和志贺氏菌在基因组上相似度高，生信算法分辨率不足则可能造成错分。根据研究表明，实验室通过使用不同的算法，如Kraken、metaOthello以及其他自研生信算法等，可有效去除由于基因组同源性带来的交叉干扰。

不同分类算法对物种级别鉴定的准确性评估

mNGS假阴性发生的原因

1.送检样本质量：mNGS检测限一般为100~1000 copies/ml，如果感染的病原体载量低于mNGS的检测限，则很难检测出来。当样本质量不佳，选取非感染病灶或非原发病灶的标本，无责任病原微生物存在或病原含量低，则容易造成假阴性。例如，肺部感染或脑脓肿患者只选择外周血样本进行检测，脑脊液代替许多脑病的脑组织进行检测，这些都容易造成结果假阴性。在临床实践中，采样时间不合适是另一因素，在一些病原体由于被吞噬细胞吞噬，要经一段时间裂解释放核酸后才能被检出，结果出现延迟性假阴性；而对于急性病毒性脑膜炎患者，病毒只在发病最初几小时或几天存在于中枢神经系统，因此距离这类患者发作较远的时间采集脑脊液样本可能无助于mNGS检测。此外，保存和运输条件不当可能导致微生物核酸（尤其是RNA）的降解，从而导致结果阴性。

2.人源核酸含量过高：高水平的人源核酸会影响mNGS对病原微生物检测的灵敏度，从而导致假阴性结果。因为人基因组约比细菌基因组大1000倍（~3×109 vs ~3×106bp)，人源核酸可以占样本测序序列的95%以上[7]。已有研究证明，微生物和人源细胞比例对mNGS检测的灵敏度有重要影响，去人源核酸可以提高检测的灵敏度。 

当人源核酸序列数占比达97%~99%时，病原微生物检测灵敏度显著降低

3.核酸提取效率低：某些病原体（如真菌、结核）的细胞壁较厚，核酸提取困难，而对于无细胞（如病毒）或细胞壁较薄的病原微生物，即使应用常规的破壁方法，也会造成核酸损失，两种情况均会造成假阴性的结果。

4.数据库不完善：罕见病原体或新出现的病原体菌株的参考序列不完整、参考数据库具有物种偏好性，以及遗传相似性过高的种属出现错误分类等，均可能导致假阴性的结果。

根据研究表明，mNGS检出的病原微生物即标本中真实存在的病原微生物，有可能是致病微生物、定植微生物或者污染菌，这些都是检测的真阳性，只是不一定都致病。而如何判断是否是致病微生物，需要提高mNGS检测准确性和灵敏度，欧蒙未一采用高效的“双重破壁”方式和创新的病原微生物富集技术，使目标病原体序列数平均提高6倍，降低mNGS报告的假阴性率以排除感染。同时欧蒙未一通过自主搭建了PAI (Pathogen Annotation and Identification) 四级数据库模型，以及全流程质控体系，尽可能减少污染，避免假阳性对临床判断造成的干扰。  

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题图 | veer.com

排版 | 张宁

审校 | 方研

原文以《宏基因组二代测序技术临床应用中假阳性及假阴性发生原因与防范措施》为题发表在《临床实验室》杂志2022年10月刊专题“临床微生物检验”-「专论」版块

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