凝胶迁移实验（EMSA）

一、实验技术流程

1、蛋白制备

1）将目的蛋白基因构建在pGEX-6P-1载体上，获得测序成功的单克隆菌株后，对其进行诱导表达。

2）进行菌株活化，取500μL-1000μL菌液至5-10mL Amp+抗性LB培养基中，37℃ 200×g过夜培养。

3）取1mL活化后的菌液加入50mL Amp+抗性LB培养基中，37℃ 200×g培养至OD600达到0.8左右（大约1.5h）。

4）加入IPTG至终浓度0.5mM，16℃ 180×g诱导16-18h。

5）诱导后的菌液5000×g 4℃，离心10min，弃上清。每50mL菌液用大约4mL PBS缓冲液重悬菌体，对重悬液在冰上进行超声破碎30-60min，每破碎6s暂停10s。

6）将破碎好的重悬液进行离心，此时重悬液应尽可能透明澄清，12000×g 4℃离心20min。上清为表达的可溶性蛋白，沉淀为包涵体蛋白，各取20-100μL加入SDS上样缓冲液进行PAGE电泳。

7）对于实验过程中收集到的蛋白应进行后续的变性聚丙烯酰胺凝胶检测，有纯化需求的也可进行进一步的纯化。

2、探针合成与标记

正反配对并包含转录因子结合位点的两条生物素标记的引物进行退火实验，得到25μM（未标记）或1μM（标记）终浓度双链引物，-20℃保存备用。使用退火缓冲，在PCR仪或者加热块上进行，98℃，5min，逐渐冷却至室温即可。

3、形成蛋白-探针复合物

按顺序加入反应物：探针，蛋白，结合缓冲液，温和混匀，PCR仪中（25℃）温育30min。

4、制备凝胶及蛋白电泳

1）制备6%非变性聚丙烯酰胺凝胶：（注意根据试剂情况按比例调整总体积）

2）加样前先在预冷的0.5×TBE buffer中120V预电泳10min，在电泳完毕后冲洗加样孔。

3）样本加入10×EMSA/Gel-Shift上样缓冲液（蓝色），点样电泳。

4）将电泳槽置于冰上或者4℃环境中，恒压100V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3cm为止。

5、转膜

在预冷的0.5×TBE中浸泡凝胶，膜，滤纸和纤维垫。取一和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好标记，用0.5×TBE浸泡至少10min。按如下顺序组装“三明治”：纤维垫，滤纸，凝胶，膜，滤纸，纤维垫。在预冷的0.5×TBE中进行转膜。转膜装置应置于冰上或者低温室中，恒压60V转膜1h。

6、交联

采用254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联60s。或312nm紫外波长照胶仪，正面朝上，交联10-15min。

7、检测

1）封闭：取合适大小容器，加入20mL Blocking buffer，放入交联过的尼龙膜，加入封闭液后轻微震荡，可在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动，室温封闭45min。

2）加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP conjugate），可预先配置含有Streptavidin-HRP conjugate的15mL Blocking buffer（1:3000稀释），室温震荡孵育25min（勿将酶标记物直接加到膜上）。

3）去掉酶联物稀释液，用洗涤缓冲液洗膜三次，每次室温轻微震荡10min。

4）配置反应底物，均匀加至膜上，室温孵育5min（可以在加完底物后，用薄膜轻轻覆盖在膜上，使底物均匀覆盖，注意不要产生气泡）。

5）曝光。

二、实验重难点

1、目前EMSA实验常用的探针是非放射性探针，在探针设计过程中需要注意以下问题：

1）防止探针封闭成环；

2）防止错位配对；

3）排除目标序列以外结合位点的；

4）防止产生空间位阻；

5）适当考虑AT/GC比例；

6）一般EMSA探针只有几十个碱基对。探针太长会产生过多结合位点导致结果分析困难，还会产生超级螺旋结构而掩盖结合部位。

2、受结合蛋白的来源和探针结合位点特点的影响，凝胶迁移实验中需要优化一些参数，以下是需要优化的因素：

1）抽提液的制备（核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解）；

2）结合蛋白的浓度；

3）探针的浓度；

4）缓冲液的配方和pH。

3、EMSA结合需要设置以下反应：

1）阴性对照反应；

2）样品反应；

3）探针冷竞争反应；

4）突变探针冷竞争反应；

5）Super-shift反应。

三、与其他同类型实验相比优势与劣势

1、凝胶迁移实验（EMSA）的优势

1）EMSA实验容易掌握，简单易行，要求的实验条件不苛刻，可以适应一定范围内的反应条件变动；

2）同位素标记探针具有非常短的半衰期并且对人的健康有害，而生物素标记更稳定、准确和方便，且亲和力高；

3）该技术可以检测的核酸分子大小和结构（单链、双链、三链、四链、环状核酸）范围很广，并可提供蛋白结合在核酸上的准确序列位置；

4）在合适的条件下，在单个反应体系中就可以通过不同复合物的形成，检测不同蛋白与不同核酸分子之间的结合情况；

5）能检测的蛋白大小范围很广，从寡肽到转录因子复合物都能检测，并且该实验既可以使用纯蛋白也可以使用细胞提取物。

2、凝胶迁移实验（EMSA）的劣势

1）无法衡量电泳过程中的化学平衡，在电泳过程中发生的快速解离会影响对复合物的检测；

2）在EMSA实验中，复合物的形成与许多因素有关，并不能直接反映分子大小或者鉴定复合物中的各种蛋白质；

3）EMSA在很大程度上属于定性实验，比如：可以检测蛋白-DNA复合物的形成与否，并不能精细的检测结合反应的上调或下调；

4）EMSA实验中并不考虑体内环境中影响蛋白DNA结合的因素，比如染色质的结构对复合物形成的影响，因此，即使EMSA实验结果反映蛋白可以与DNA结合，在体内环境中也许还需要其它条件才能完成结合反应。

四、我司该实验业务优势

1、应用广——可以用于不同的蛋白与不同核酸分子的结合情况；

2、安全——生物素标记更加稳定和安全；

3、专业——专业的技术服务团队。

五、常见问题答疑

1、在DNA探针的选择上，要考虑哪些重要因素？

目的DNA的长度应小于300bp，以有利于非结合探针和蛋白DNA复合物的电泳分离。双链合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝胶迁移实验中用作探针。如目的蛋白已被鉴定，则应用短的寡核苷酸片段（约为25bp），这样结合位点可和其他因子的结合位点区别开。长的限制性酶切片段可用于对推定的启动子/增强子区域内的蛋白结合位点定位。随后可用DNaseI印迹对蛋白结合的特异区域在DNA序列水平上作出分析。

2、EMSA同DNA pull-down、ChIP的区别？

EMSA是用特定序列的标记探针，同待验证蛋白孵育后进行Native-PAGE凝胶电泳，如果存在同探针结合的蛋白，则会出现电泳迁移率明显低于自由探针的条带出现。DNA pull-down是将探针结合在凝胶/磁珠上，以此收集同该DNA探针发生互作的蛋白。ChIP实验中所检测的DNA-蛋白互作则发生在活组织细胞内。

3、酵母单杂交、EMSA、LUC、ChIP-qPCR它们是互为验证的实验，优先做哪个呀？需要几个实验都做吗？

一般实验先通过酵母单杂筛选互作基因，然后单杂和EMSA都是在体外验证是否存在结合（体内并不一定互作），还需要双荧光素酶（Dual-LUC）和ChIP-qPCR进一步验证体内是否存在互作。一般体内、体外都需要至少一个，且EMSA是所有实验里面安排相对靠后的，因为该实验需要先知道启动子上可能与转录因子结合的motif序列是什么，根据motif序列设计探针再进行实验。

4、为什么看不到迁移带？

1）标记的DNA探针量太少或者探针有降解；2）某些蛋白和探针的结合条件比较特殊，需要优化结合体系；3）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足；4）样本中没有可以与探针结合的蛋白；5）探针与蛋白无特异性的相互作用；6）转膜效率低，蛋白或者探针未转移到膜上；7）曝光或者成像时间过短。

5、EMSA实验存在哪些主要风险？

除了探针序列具有理论预测性、本身属于探索性实验的情况之外，组织细胞中该转录因子丰度较低、只在特定条件阶段表达，特定蛋白同DNA结合需要一定的离子或辅助因子条件（如Mg2+、Zn2+、ATP），重组表达蛋白在DNA结合活性方面同天然蛋白存在差异，结合力较弱，需要其他蛋白间接作用于DNA等情况下，都难以获得迁移条带。此外，当研究的蛋白本身pI较大（如大于8.0），蛋白在native电泳中将难以随同DNA一起向阳极泳动，或在电泳最初阶段同DNA解离开。

6、实验背景高是为什么？

1）蛋白的质量不高，杂质多；2）转膜时使用了Western blot使用的工具，没有清洗干净；3）TBE溶液中有悬浮物；4）曝光或者成像时间过长；5）封闭时间不足或者效率不高；6）洗涤效果不佳；实验过程中膜没有一直处于湿润状态。

7、EMSA测定需要多少量的蛋白与标记的探针？

对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白，部分纯化蛋白，粗制核抽提液需作优化：一般所用纯化蛋白的量在20-2000ng间，可将蛋白:DNA的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA的5倍；用粗制核抽提液，需要2-10μg蛋白形成特异的复合物；部分纯化蛋白与粗制核抽提液应保存在-80℃、探针应保存在-20℃以防止降解；无论探针或是结合蛋白都应避免多次冻融。

8、用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开？

1）将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合，蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为6%，在特定条件下可用高或低的浓度。也可将TGE缓冲液（12.5mM Tris，pH8.3，95mM甘氨酸，0.5mM EDTA）用于不稳定的蛋白/DNA复合物。在4℃进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。2）当带型不紧密出现拖尾时，表明复合物存在解离。凝胶必需完全聚合，以避免带型拖尾。如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量，或盐的浓度过量不适用于这一反应。在含抽提液的带中不含游离探针或复合物，但只含探针的带中有探针表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。

9、请问在EMSA实验中蛋白纯化出现包涵体，怎么解决？

包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。

细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40%~95%，此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。包涵体复性后，只要能保持活性和原来的功能也可以用来做EMSA，再就是减少蛋白的表达速度和换其他菌株。