OSBPL2介导RhoA/ROCK2信号通路调控听觉细胞肌动蛋白细胞骨架

目的：探索氧化固醇结合蛋白样蛋白2（oxysterol binding protein-like 2，OSBPL2）对听觉细胞肌动蛋白骨架形态和功能的影响及其相关分子机制。方法：采用OSBPL2基因敲除（Osbpl2-KO）HEI-OC1细胞探讨OSBPL2缺陷对听觉细胞肌动蛋白细胞骨架形态和功能的影响；扫描电镜观察Osbpl2-KO小鼠毛细胞静纤毛形态；Western blot实验检测HEI-OC1细胞和耳蜗内 Rho/ROCK 信号通路关键效应因子 Rho 激酶 2（Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase 2，ROCK2）、Lim 激酶 1（LIM domain kinase 1，LIMK1）、肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白1（actin depolymerizing factor/cofilin 1，ADF/CFL-1）的表达水平。结果： Osbpl2-KO HEI-OC1细胞微丝骨架中纤维肌动蛋白（F-actin）的分布明显减少，细胞外周微刺突和丝状伪足明显减少，细胞迁移能力明显减弱；扫描电镜下观察发现Osbpl2敲除导致小鼠耳蜗内毛细胞静纤毛变短且排列紊乱；Western blot检测结果表明，在HEI-OC1细胞和小鼠耳蜗中OSBPL2-KO均导致RhoA/ROCK2信号通路的抑制。结论：在听觉细胞中OSBPL2介导的RhoA/ ROCK2信号通路在维持肌动蛋白细胞骨架形态和功能的过程中发挥重要的调控作用。

Objective：To explore the effect of oxysterol-binding protein-like 2（OSBPL2）on the actin cytoskeleton in auditory cells and its related molecular mechanisms. Methods：OSBPl2 knockout（Osbpl2-KO）HEI-OC1 cells were used to investigate the effect of OSBPL2 deficiency on the the actin cytoskeleton in auditory cells. The stereocilia onmouse hair cells were observed by scanning electron microscopy. Western blot was used to detect the expression of Rho - associated coiled - coil - containing protein kinase 2 （ROCK2），Lim domain kinase 1（LIMK1）and actin depolymerizing factor 1（ADF/CFL - 1）in HEI -OC1 cells and mouse cochleae. Results：In Osbpl2-KO HEI-OC1 cells，the distribution of F-actin in the microfilament skeleton was down-regulated，the pericellular microspikes and filopodia were noticeably reduced，and the cell migration ability was significantly weakened. In vivo，OSBPL2 deficiency resulted in shortened and disordered stereocilia on mouse inner hair cells. Western blot assay showed that OSBPL2 deficiency led to the inhibition of RhoA/ROCK2 signaling pathway in HEI - OC1 cells and mouse cochleae. Conclusion：OSBPL2 mediats RhoA/ROCK2 signaling pathway in auditory cells and plays an important role in maintaining the morphology and function of actin cytoskeleton.

氧化固醇结合蛋白样蛋白2 ； 肌动蛋白细胞骨架 ； RhoA/ROCK2信号通路 ； 肌动蛋白解聚因子 ； 丝切蛋白1

OSBPL2 ； actin cytoskeleton ； RhoA/ROCK2 signaling pathway ； ADF ； cofilin-1

氧化固醇结合蛋白样蛋白 2（oxysterol binding protein⁃like2，OSBPL2）与氧化固醇结合蛋白（oxys⁃ terol binding protein，OSBP）同源，属于OSBP 相关蛋白（OSBP⁃related protein，ORP）家族成员，作为一种重要的固醇感受器，参与了脂质代谢、囊泡运输、信号转导和细胞骨架调控等生物学过程[1]。本课题组在前期研究中发现OSBPL2是常染色体显性遗传性非综合征型耳聋（DFNA）的致病基因之一[2]，OSBPL2 敲除的巴马小型猪以及小鼠模型均表现为进行性听力损失，并伴随有毛细胞静纤毛的形态异常[3-4]。毛细胞静纤毛是主要由肌动蛋白构成的特化细胞器，静纤毛以及肌动蛋白骨架功能正常是听觉发生的必要条件。OSBPL2在耳蜗内毛细胞和外毛细胞的静纤毛中均有定位[5]，提示OSBPL2在听觉细胞的肌动蛋白骨架调控中可能发挥重要作用。有研究发现，OSBPL2缺失会导致HuH7细胞中黏着斑激酶 （focal adhesion kinase，FAK）的磷酸化水平降低，并进一步抑制细胞肌动蛋白骨架重塑、伪足与细胞极性形成、细胞迁移、细胞黏附和细胞周期[6]。此外， OSBPL2也可以作为肌动蛋白细胞骨架的脂质感受器，通过介导RhoA信号通路影响肝脏细胞的迁移、黏附和增殖[7]。RhoA 是Rho GTPase 家族重要成员之一，参与了多种以肌动蛋白为基础的生物学过程，特别在肌动蛋白细胞骨架的重排中发挥重要调控作用[8]。但在内耳组织和听觉细胞中，OSBPL2是否存在同样的调控机制仍需进一步研究。本研究将从体内外水平研究OSBPL2参与听觉细胞肌动蛋白细胞骨架调控的机制，为进一步探索 OSBPL2 生物学功能及其突变致聋机制提供理论依据。

小鼠耳蜗感觉上皮永生化细胞株 HEI⁃OC1 细胞及其 OSBPL2 敲除（Osbpl2⁃KO）细胞株由本实验室构建和保存[9]，Osbpl2⁃KO 小鼠及其同窝野生型 （Osbpl2⁃WT）小鼠由南京医科大学动物中心净化并配繁[4]。实验经过南京医科大学动物福利伦理委员会同意（伦理编号：IACUC⁃1801003⁃1）。

实验所用抗体：纤维肌动蛋白（fibros actin，F⁃ actin）抗体（MA1⁃80729，上海赛默飞）、OSBPL2抗体 （14751 ⁃ 1 ⁃ AP，武汉 Proteintech 公司）、GAPDH （5174S，CST，美国）、RhoA（A19106，武汉爱博泰克）、Rho 激酶 2（Rho⁃associated coiled⁃coil⁃contain⁃ ing proteing kinase2，ROCK2）（A5698，武汉爱博泰克）、肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白 1（actin depoly⁃ meriza factor/cofilin 1，ADF/CFL ⁃1）抗体（5175，CST 公司，美国）、Lim激酶1（LIM domain kinase1，LIMK1） 抗体（A16664，武汉爱博泰克），Phospho⁃LIMK1抗体 （APO387，武汉爱博泰克），山羊抗鼠、抗兔IgG二抗 （SA00001⁃1、SA00001⁃2，武汉 Proteintech 公司）、荧光标记山羊抗鼠、抗兔二抗（1741782、1748346，上海赛默飞）。

其他试剂：Western及IP细胞裂解液（P0013，南京碧云天）、RIPA 裂解液（P0013B，南京碧云天）、 SYBRRGreen Master Mix（Q131，南京诺唯赞）、TGX Stain⁃FreeTM FastCastTM Acrylamide Kit、基因扩增引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

在 DMEM 培养基中加入 10%胎牛血清制成完全培养基。将 HEI⁃OC1 细胞培养在 DMEM 完全培养基中，置于10% CO2饱和湿度的33℃细胞培养箱中培养，当细胞密度达到80%~90%，用胰酶消化、传代并冻存，以备后续实验使用。

取 Osbpl2⁃KO 小鼠和 Osbpl2⁃WT 对照小鼠，麻醉后用生理盐水进行心脏灌注。待灌注出的生理盐水澄清后，给小鼠断头，取出耳蜗，体视显微镜下用镊子去除多余肌肉组织并在蜗顶打洞后多聚甲醛固定过夜，第2天将耳蜗取出用PBS清洗3遍后，置于EDTA慢脱钙液中，脱钙7~10 d，脱钙过程中可用镊子夹一下耳蜗来衡量脱钙状态，镊子夹起富有弹性则表示脱钙完成。

将完成脱钙的小鼠耳蜗置于体式显微镜下，采用显微镊与显微剪分离基底膜，浸入 5%戊二醛固定过夜；将固定后的基底膜依次浸入 50%、70%、 90%、100%乙醇中脱水各 5 min，冻干后喷金；扫描电镜下观察毛细胞静纤毛的形态与排列，并在不同观察视野中选取17~18个细胞，Image J统计静纤毛长度和宽度。

待细胞密度为60%~80%时，吸弃原培养基，在培养板中将已爬好细胞的玻片用4℃预冷PBS洗涤 3遍；4%多聚甲醛固定爬片30 min，PBS浸洗玻片3 次，每次3 min；0.3% Triton X室温穿膜30 min，山羊血清封闭 30 min；加稀释后的一抗 4℃孵育过夜， PBS洗涤3遍，每遍5 min，加稀释后的二抗室温避光孵育1 h，PBS洗涤3遍后，DAPI室温孵育10 min，封片，荧光显微镜拍片，在观察视野中选取8~10个细胞，Image J分析F⁃actin荧光强度以及ADF/CFL⁃1的表达定位。

用直尺在6孔板底部画间隔1 cm的直线。将消化下来的细胞重悬移入6孔板，每孔约5×105 个细胞，待细胞生长融合成单层状态后，用灭菌的200 μL枪头垂直于6孔板底部横线划线，PBS洗涤3遍使得划痕边缘清晰，随后加入无血清培养基。分别在0、12、 24 h用倒置荧光显微镜拍照保存，使用Image J软件进行分析。

取处在对数生长期的细胞株培养瓶，弃去培养液后，PBS清洗3遍。加入含蛋白酶抑制剂的RIPA 强裂解液于冰上裂解15 min；将细胞裂解液转移至 1.5 mL离心管，冰浴中超声破碎处理3次，每次5 s； 12 000 r/min离心10 min（4℃），收集上清，采用BCA 法测定各样品蛋白浓度。取等量蛋白，采用 12% SDS ⁃PAGE 电泳分离蛋白，并转移至 PVDF 膜上。 5%脱脂奶粉溶液封闭2 h，PBS洗涤后加入一抗4℃ 孵育过夜，加入相对应二抗室温孵育2 h，PBS洗涤后采用增强化学发光显色法显色，采用凝胶成像系统观察拍照。

使用 TRIzol 提取 HEI ⁃OC1 细胞总 RNA，测定 RNA 浓度后，取 1 μg 总 RNA 反转录成 cDNA，然后进行实时荧光定量PCR（real⁃time quantitative PCR， qRT ⁃ PCR）检测。采用 20 μL 扩增体系： SYBR®Green Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。扩增程序如下：预变性 95℃ 5 min；变性95℃10 s，退火/延伸60℃ 30 s，共 40个循环，目标基因CT值使用GAPDH基因CT值校正。引物序列见表1。

每组实验至少重复 3 次，使用 GraphPad Prism 软件进行相关统计学分析。实验数据采用均数±标准差（x-±s）表示，两独立样本采用t检验进行组间比较，P