一文看全72家测序仪公司！

1953年，随着DNA双螺旋结构的解密，人类开始惊叹于生命密码的神奇。这么简单的分子结构，是如何实现如此复杂生命系统的维系和传递呢？后来科学家们轰然领悟：原来生命密码是一门语言，一门有着高级语法、语义和应用环境的语言！于是，解读这门语言的技术也就随之诞生了。

1964年，美国康奈尔大学的生物化学教授罗伯特∙霍利（Robert Holley）发明了最早的测序技术。他用不同的RNA酶对酵母Ala-tRNA进行酶切，根据反应后产物中的重叠序列间接推导完整序列，最终分析出酵母Ala-tRNA的77个核苷酸序列，Ala-tRNA也因此成为生命科学史上第一条被“解读”的核苷酸序列。这种测序技术叫做前直读法，虽然以现在目光看来，该技术流程繁琐，难以重复，而且无法给双链DNA测序，但此法开创了测序技术的先河。

之后的十余年间，生命科学领域的3个重要技术日趋成熟——分子克隆、凝胶电泳和放射自显影技术。分子克隆技术是将目的DNA片段装入载体（比如质粒），然后把载体转入宿主细胞（比如大肠杆菌）中，通过细胞的扩增、繁殖来获得大量相同的DNA片段。而凝胶电泳和放射自显影技术的联合使用，极大地提高了DNA片段的检测长度、数量敏感度和精准度。基于这三大神技，直接在凝胶上按顺序直观读取DNA序列的测序技术，也就是直读法，便应运而生。

DNA测序技术的奠基人，当属美国康奈尔大学的华人生物学家吴瑞。吴瑞于1970年首创DNA测序方法，又于1971年将引物延伸法（primer extension）用于DNA测序，为日后的Sanger测序法提供了技术基础。此外，吴瑞还是中美生物化学与分子生物学联合招生项目(China–United States Biochemistry and Molecular Biology Examination and Application Program， CUSBEA)的奠基者。在改革开放之初，不少美国大学因为不了解中国学生的素质，对招收中国留学生心存顾虑，吴瑞运用自己在美国学术界的影响力促成了这个项目，使优秀的中国学生能在美国接受先进教育和培训，为中国生命科学领域培养了大批人才。

1975年，英国大神级生物化学家弗雷德里克∙桑格（Frederick Sanger），在吴瑞测序方法的基础上发明了生命科学领域划时代的测序技术——双脱氧终止法（Dideoxy termination method），又称Sanger测序法。两年之后，他利用此技术成功测序出ΦX174噬菌体的基因组序列——这是人类解读的第一个完整的生物体基因组全序列。

桑格被认为是大神级人物，实在是名至实归。他分别在1958年和1980年获得诺贝尔化学奖，是史上第四位两度获得诺贝尔奖，以及唯一一位两次获得化学奖的人。他在37岁的时候就完整测定了胰岛素的氨基酸序列，证明蛋白质具有明确构造，并于三年后首次获得诺贝尔化学奖。而他第二次获得诺贝尔奖，正是因为发明了Sanger法，发明化学降解测序法的沃特∙吉尔伯特（Walter Gilbert）与桑格分享了当年的诺贝尔化学奖，然而化学降解测序法如今已不再使用。桑格因此被称为“基因组学之父”，如今英国剑桥大学的桑格研究所正是以他的名字命名。

与直读法相比，Sanger法明显极具优势：试剂无毒，操作容易，结果准确而稳定。因为这些优点，Sanger法很快风靡全球生命科学实验室，科学家们也开始对破解上帝留给人类的基因“天书”蠢蠢欲动。可以说，1990年正式启动的“人类基因组计划”能顺利开展，Sanger法是关键。如果没有Sanger法，基因组学这个学科就不会这么快发展起来。

Sanger法的发明带动了基因组学的发展。而之前的三大神技，因为其繁琐的实验操作，影响了测序的效率。因此当时各大生物公司的研究重点，就是改进这些技术，使它们自动化和高效化。直到1986年，也就是Sanger法发明11年后，美国的ABI公司（Applied Biosystems Inc.）拔得头筹，它利用当年发明的四色荧光标记法，改进了电泳技术，并用扫描仪替换了放射性物质的使用，发明了全球第一台商品化的平板电泳全自动测序仪ABI 370A。

此后，ABI公司不断努力，又用毛细管电泳技术替代了原有的平板电泳技术。因为平板电泳技术的测序数量有限，而且制作电泳胶与加样不能自动化，而毛细管电泳技术可以实现制胶和加样的自动化，减少了试剂的损耗，提升了分析的速度，测序数量也更大。

1998年，ABI公司终于推出了ABI Prism 3700毛细管测序仪，它的上样、数据收集、质控、初步分析都实现了自动化，是第一台真正的全自动测序仪。此后推出的升级版ABI 3730机型，更是为人类基因组计划立下了赫赫战功，至今仍然是Sanger法测序仪的主力机型，这一型号测序仪的测序结果被称为“黄金标准”。至此，ABI公司在Sanger法测序时代的霸主地位再也无可撼动。 

在ABI公司的王霸之路上，也出现过不少有力竞争对手。例如，美国的LI-COR公司和Molecular Dynamics公司等，但这些对手后来都因种种原因衰落，退出了历史潮流。正所谓“滚滚长江东逝水，浪花淘尽英雄”。而这样的故事，在接下来的测序仪发展历程中，还在不断地上演。

2003年，随着人类基因组计划的完成，遗传学研究正式进入了基因组学时代。测序向着更大样本量、更多数据量、更多物种的方向迅速发展。而这些发展方向，最终都是为了改善两个最重要的指标：成本和通量（测序效率）。

第一个人类的基因组，从1990年到2003年，花费38亿美金才完成。就算在2003年之后，用Sanger法测序一个人的基因组，成本也高达5000多万美元。为了降低测序成本，美国国立卫生研究院于2003年发起了“5年内实现10万美元=1个基因组”和“10年实现1000美元=1个基因组”的两步走战略计划，以鼓励开发新的测序技术。

为了提高效率，节省成本，曾参加人类基因组计划的美国科学家克雷格·文特尔（Craig Venter）早在上世纪九十年代就开始用“鸟枪法”进行基因测序，具体做法是把要测序的基因组切成随机碎片，同时对这些碎片进行测序，再将所得的测序结果拼合起来。这种方法就好比让很多人同时乱枪射击森林里的鸟群，在很短的时间内，就可以将林子中的大部分鸟打中。鸟枪法能够成功的核心，是因为IT技术的突飞猛进、特别是超级计算机的广泛应用，使得通过信息技术还原基因组的本来面目成为可能，进而诞生了“BT（生物技术）+IT”的新交叉学科——生物信息学。

在鸟枪法的原理基础上，科学家发明了高通量测序技术，提高单位时间内产生的数据量。2005年第一台商用高通量测序仪454横空出世，由美国的454 Life Sciences公司于2005年开发，后被罗氏收购。2006年英国剑桥的Solexa公司推出基于SBS技术的高通量测序仪，后被Illumina公司收购。Sanger法时代的霸主ABI晚了半个身位，于2007也推出了自己的SoLiD高通量测序仪。

在最初的5～6年间，这三家公司不断地推出新品，刷新各自测序仪通量、读长和成本的记录。这样的竞争一直持续到2010年左右，454 Life Sciences公司和ABI公司的测序仪因为自身的各种不尽人意之处，难逃停产的命运。

这一阶段赢在最后的是Illumina公司。该公司率先进军大型基因组研究中心，抢占了先机。此后它又推出了高通量的HiSeq系列测序仪，通量远超另外2家公司。“三雄争霸”的年代终于结束，Illumina公司成为高通量时代当之无愧的霸主。

（尹哥和Illumina公司的王牌武器：HiSeq系列测序仪）

自从2010年推出HiSeq2000系列测序仪，Illumina便开始在提高通量的道路上高歌猛进，并在2017年使人类基因组测序成本降低到了1000美元，率先实现了“一千美元测序一个人类基因组”的设想。

然而，科技领域从来就不缺挑战者。首先，曾经的失败者454 Life Sciences公司和ABI公司，以一种特殊的形式“联盟”了。454 Life Sciences的创始人乔纳森·罗森伯格（Jonathan Rothberg）创办了新的科技公司Ion Torrent，并于2010年成功推出了当时世上体积最小、检测成本最低的测序仪PGM。同年，Ion Torrent被Life Technologies公司收购。而这家Life Technologies公司，正是由ABI公司与Invitrogen公司合并而成！之后，罗森伯格的团队开发出Proton测序仪，声称一天就能完成人类基因组测序，成本仅为1000美元。可惜技术发展并不尽如人意，在多次跳票后，Proton测序仪如今已经基本退出科研市场，Life公司也随后被Thermo Fisher公司收购。

直到此时，所有的测序仪争霸战还只是发生在美国。2013年后，中国和英国也开始相继加入这个生命技术竞争顶级俱乐部，开始了“三国争霸”的时代。

（尹哥和Ion Torrent公司生产的Proton测序仪）

这还得从美国的Complete Genomics（CG）公司说起。CG公司是个提供测序服务的生物公司，他们测序结果的准确率是业内公认最高的，测序所用的都是自产的测序仪，但他们生产的测序仪概不外售。2013年，中国的华大收购了CG公司，消化其核心技术，并研发出具有自主知识产权的小型测序仪。2015年，华大推出第一代BGISEQ-500测序仪，将人类基因组测序成本降到600美元，这是人类基因组测序价格首次下降到1000美元以内。接着，2018年，华大推出了T7测序仪，这款仪器一天就能完成60个人类基因组测序，是当今全世界公开发售的通量最高的测序仪。2020年和2021年，华大又分别推出超高通量测序平台DNBSEQ Tx和快捷型测序仪DNBSEQ-E5。华大测序仪的迅速崛起，让世上又多了一家在技术上可以与Illumina一决高下的机构。

（华大智造生产的DNBSEQ E测序仪）

（尹哥和华大智造生产的T7测序仪）

测序成本的下降，使更大规模的测序成为可能。一些国家已觉察到了基因大数据的价值，特别是近两年，纷纷推出了若干个国家级别的大人群基因组测序计划。

2018年5月，美国国立卫生研究院（NIH）启动了名为“我们所有人”（All of Us）的人类基因组研究超大队列研究计划。该计划预计在10年的时间完成100万人的基因组测序。而主要使用的技术，就来自美国的两家测序仪公司——Illumina和PacBio。

英国将基因组学比作引领工业革命的蒸汽机，正开展世界最大样本量的“英国五百万人基因组项目”，2018年10月第一期已完成5万人的全基因组，预计2025年完成500万人全基因组测序，同时将基因检测纳入医保。

2019年8月，21个欧盟国家共同签署协议，2022年欧盟要联合起来完成百万人基因组项目的测序，同时要在欧盟成员国内部跨境共享数据。

法国、丹麦、芬兰、新加坡、俄罗斯、阿联酋等国家也纷纷开始启动和开展各自的国别基因组计划，不甘人后。

随着高通量测序的成本不断下探，科学家们对生命本质的探索也在不断深入。其表现之一，就是对更长的基因序列的追求——追求测序技术上长读长技术的突破。

人的基因组是由46条（23对）染色体组成的，而基于“鸟枪法”的短读长拼接方法，始终会有一些区域没有很好的被完整组装。最好的办法，就是直接把整条染色体一次性从头测到尾！现在的技术虽然还没有到如此完美，但也有了本质的突破。美国PacBio公司是单分子测序领域的佼佼者之一。从2010年推出第一台RS单分子测序仪开始，PacBio已经相继推出4款主要机型。但由于该测序仪工艺过于复杂，造成了成本过高和准确率过低的问题。Illumina公司意识到PacBio测序仪的潜力，于2018年底斥12亿美元拟收购这家公司，而在2019年10月，英国监管机构则提议阻止这场收购，原因是“保持该国以及全球测序市场的竞争”。

这就要提一句来自英国的ONT（Oxford Nanopore Technologies）公司了。该公司生产的也是读长超长（比PacBio测序仪读长更长）、通量超大的单分子测序仪，产品最小可以做到U盘大小，特别适合在特殊环境下进行快速测序。同时，该系列测序仪的测序成本也特别低。它们唯一的缺陷就是准确率不够理想，而测序成本相比于短读长技术也比较高。

而中国的华大，则研发了单管长片段读取技术（single tube long fragment reads，stLFR）。它通过巧妙设计，给来自相同DNA分子的短读长测序片段都标记上相同的分子标签（co-barcode），从而把短读长连成了长读长。这种方法在实现了长读长的同时，还保留了高通量测序的低成本、高准确度的优势。

另外一个重要的方向就是单细胞测序。

生命，从单细胞的草履虫到自封“万物之灵”的人类，都是由细胞组成的。拥有相同基因组的细胞，通过不同的基因表达，造就了不同类型的细胞。同时，每个细胞又在正确的时间、正确的位置，与其它细胞共同协作，从而鬼斧神工地构成了有机生命体。要了解生命活动的本质，就需要将测序的“分辨率”提高到“单细胞”的水平。现在大部分的测序，测的是某一块组织或者血液中成千上万细胞共同表达的结果，分辨率很低，而所有研究者都喜欢高分辨率的结果。

在单细胞测序技术发展的短短10年时间，已经涌现出众多的技术。总体趋势正在从单个或者少量细胞的研究，向整个组织中所有细胞类型的研究发展。有些技术甚至已经开始探索真正的“空间单细胞测序”——对单个细胞进行基因测序的同时，还记录了细胞在原组织中的位置信息。如果这个技术最终普及，将能观察到最小像素级别的生命活动！ 

21世纪注定是生命科学的世纪。超级测序仪争霸战，正是解读生命密码过程中的核心竞争焦点。回顾短短30年历史，它跟其它技术领域的竞争类似，都是被技术浪潮所驱动。长江后浪推前浪，谁都不知道现在的巨头还会称霸多久，也不知道下一个横空出世的后起之秀会是哪位，但它们都将被载入史册，在测序技术的发展史上画上浓墨重彩的一笔！

（以上摘自《生命密码2》）