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表2 NextSeq 550AR/MiSeq平台上机文库标准 2. 质检篇 Q:文库如何进行质检?质检报告会提供哪些内容呢? A:上机之前,我们会使用Agilent 2100 或 LabChip GX Touch 生物芯片分析系统检测文库片段大小,并使用StepOnePlusTMReal-Time PCR System 进行 QPCR,对文库的有效浓度进行定量,并在质检报告中判定该文库的片段大小和浓度是否符合上机要求。 Q:文库质检不合格的原因有哪些?会造成什么影响?有哪些解决方案? A:常见的文库质检不合格原因: 1)浓度低 影响:浓度偏低的文库可能定量不准,影响该文库的产出;在与正常文库pooling时,可能导致pooling后的浓度达不到上机要求,影响整条lane的产出。 解决方案:提高建库起始量和纯化回收效率,或适当增加建库过程中扩增循环次数,但是增加扩增次数也会导致dup率增加。 2)二聚体污染 影响:非目的片段会给文库的定量带来误差,影响文库产出。此外,二聚体的优势扩增会导致整条 lane 文库有效数据产出偏低,影响 clean reads 的比率。 图1 二聚体污染 解决方案:适当减少建库过程引物用量;调整文库纯化时磁珠的比例。 3)小片段污染 影响:非目的片段会给文库的定量带来误差,影响文库产出。此外,小片段的优势扩增会导致同一条 lane 其它文库产出偏低,接头污染 reads 增多,影响 clean reads 率,影响有效数据比例。 图2 小片段污染 解决方案:优化片段打断和文库纯化条件,如果小片段是目的片段,可以包lane测序,并选择较短的测序读长。 4)大片段污染 影响:首先非目的片段会给文库的定量带来误差,影响文库产出。其次文库片段偏大,成簇时可能会跨孔长簇,这部分数据会被仪器过滤掉,影响数据产出。此外,较长的文库片段也会形成较大的簇,会导致荧光信号减弱,机器在碱基识别时,准确率降低,Q30 降低,同时也会影响数据量。 图3 大片段污染 解决方案:优化片段打断条件。 5)二峰图过宽 影响:峰图过宽会给文库的定量带来误差,影响文库产出。且文库片段分布偏大或偏小会影响数据产出和Q30,可参考小片段污染和大片段污染。 解决方案:优化片段打断和文库纯化条件。 3. 测序篇 Illumina平台的核心原理是边合成边测序。在测序的过程中,Read1、Index7、Read2的测序引物依次与模板结合。以HiSeq X平台PE150试剂为例,如果只有P7端存在8位Index,那么测序时Read1+Index7+Read2的反应数是150+8+150 cycles;如果需要测8位的Index7和Index5,测序的顺序就是Read1+Index7+Index5+Read2,反应数为150+8+8+150 cycles。需要注意的是HiSeq X平台在对文库的Index7和Index5测序时,模板链是反向互补的,而NovaSeq 6000平台对双端Index测序时模版链则是同一条,也就是说同样的Index5序列在不同平台上测到的序列可能是反向互补的,因此在填写Index序列时需要选择测序平台对应的序列。 近期,我们推出了全新的快速周期产品:NovaSeq S4试剂单一文库包lane测序,从样本接收到云交付仅需3天,硬盘交付仅需4天。HiSeq X单一文库包lane测序6个自然日即可交付结果。希望以上的分享能够对各位老师有所帮助,文库送到安诺了,实验结果的春天还会远吗~ 文案:纯测序产品经理 齐钰 设计:胡珊珊返回搜狐,查看更多 |
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