杂交瘤细胞分泌非特异性抗体，原因竟然是……

此次席卷全球的新冠疫情让人们认识到了疫苗的重要性。如果说，免疫系统是御病毒于体外的“万里长城”，那单克隆抗体就是辅助人体围歼病毒的“尖兵利器”。抗体发现和疫苗开发对人类生存的意义不言而喻，抗体除治疗感染疾病外，在癌症以及自身免疫性疾病等领域也发挥重要作用。

众所周知，单克隆抗体具有特异性。但是在实验过程中，想必大家不时会遇到一个克隆测出多对抗体序列的情况。这显然是违背我们对杂交瘤抗体的常规认识。单克隆抗体的非特异性因生产细胞株的不同而具有差异，这样的结果可能会影响患者的诊断分级和治疗。所以，在实验过程中，关注抗体的多样性就会显得十分重要。今天我们就和大家聊一聊杂交瘤非特异性的那些事。

图片来源：参考文献[1]

这篇文章对单克隆抗体多样性进行了深入报告。研究随机选取了185个杂交瘤样本，其中68.1%的杂交瘤样本不含额外的翻译产物，余下的31.9%含有多个额外的功能性重链或轻链。通过酶联免疫或者免疫组化实验，发现这些额外功能性重轻链的杂交瘤降低了目标抗体的特性。杂交瘤中大量丰富的mRNA转录本并不一定提供正确的特异性抗体表达。

所以，在克隆抗体基因时，需要对所有可能的VH和VL组合进行功能验证，以识别那些具有最高亲和力和最低交叉反应活性的组合。那么，杂交瘤细胞分泌非特异性抗体的原因究竟是什么呢?

杂交瘤样本非特异性的原因

第一种：额外产生一条功能性轻链的杂交瘤细胞，能够分泌三种不同的抗体，导致非特异性靶点结合。这里显示了有两个抗原结合功能域。

图片来源：参考文献[1]

第二种：额外产生一条功能性重链和轻链的杂交瘤细胞，能够分泌10种不同的抗体(随机组合)，导致非特异性靶点结合。这里显示了有4个抗原结合功能域。

图片来源：参考文献[1]

第三种：多细胞融合(一个骨髓瘤细胞与多个脾脏细胞)、异常重组(一个脾脏细胞含有多个链重组)、染色质复制、断裂突变等会导致产生的杂交瘤表达多条正常或不正常的重轻链序列。

图片来源：参考文献[1]

研究人员发现126种杂交瘤，占比68.1%的杂交瘤包含1条生产重链和1条生产轻链基因，而59种杂交瘤，占比31.9%的杂交瘤包含不止1条生产重链和轻链，在含有额外链的杂交瘤抗体中，53种杂交瘤占比28.6%含有额外生产轻链，2种杂交瘤占比1.1%含有额外重链基因产物。

图片来源：参考文献[1]

由此可见，杂交瘤细胞分泌抗体的非特异性主要来自于能够表达多条重轻链序列。那么，这种非特异性会带来什么影响呢?

杂交瘤样本非特异性的影响

1.非特异性抗体的出现导致正常抗体比重下降，单位抗体蛋白效价降低

随机挑选的几种针对不同抗原的杂交瘤表达产物及其含有的重轻链重组表达抗体的结合特异性进行了比较(7个被测试的杂交瘤样本中有6个含有额外的功能性序列)。杂交瘤SUZ12中，IgG重链轻链配对产生的VH2/VL2即便是低浓度的抗原，也表现出极高的非特异性结合。在pol2ser5这株杂交瘤中，表达量最高的HC/LC组合，重组recAbVH1/VL1 未能表现出特异性结合，而表达量较低的VL2与VH1表现出了特异性的结合。

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)比较亲和纯化杂交瘤IgG与VH/VL组合产生的相应重组IgG的结合情况(图片来源：参考文献[1])

2.重组抗体与杂交瘤抗体相比在免疫组化实验中表现出更好的特异性和更高的灵敏度

从A蛋白(IgG2a和IgG2b)或G蛋白(IgG1和IgG3)上纯化杂交瘤抗体和重组抗体。纯化的杂交瘤抗体被稀释到染色弱阳性的程度如下图所示，当检测到额外的VH或VL链时，从重组表达中纯化的抗体比从杂交瘤上清中纯化的抗体敏感性更高(图A:cytokeratin 7，ß2microglobulin，图B:calponin, EpCAM)。有趣的是，在仅鉴定出一个功能链VH和VL的杂交瘤例子中也观察到了这一点(图C:MUC1, WT1)，与ELISA结果相一致。NGS鉴定了含有一个以上附加功能链(3A)的抗体、一个附加功能VL(3B)的抗体和没有附加功能链(3C)的抗体。抗体从杂交瘤上清或重组抗体在HEK细胞表达后，在相邻切片上检测相同浓度。对于每个抗体，使用提供信号的纯化杂交瘤抗体的最低浓度，以及较高浓度的ß2微球蛋白，EpCAM和MUC1。与杂交瘤抗体相比，重组抗体具有更强的特异性。

不同杂交瘤或其相应的重组抗体中纯化的单克隆抗体进行免疫组化染色(图片来源：参考文献[1])

从以上结果可以看出，这次研究的185个杂交瘤样本包含了之前所有报道过的遗传变化现象，如基因重组、小片段插入缺失、移码突变、点突变及轻链异常。如此涵盖之广泛，充分说明了这些遗传变化是额外功能性重轻链产生的的不同起源。且这些额外的功能链中，大鼠杂交瘤样本显示出更高的非特异性：大鼠78.3%(29/37)，小鼠：19.9%(29/146)。利用NGS测序和PCR克隆技术都鉴定出杂交瘤具有额外功能链。那么如何正确识别功能链是研究者必须考虑的问题。

识别编码功能性抗体序列

1.最好方法是将重组抗体与杂交瘤中产生的抗体进行相同的功能结合试验

重组抗体的功能结合试验应与杂交瘤上清获得的IgG具有相同或更好的亲和力和特异性，特别是在检测到额外的VH/VLcDNAs时。所有通过NGS或者PCR不同引物扩增获得的所有可以配对的VL和VH都需要逐个配对，逐一验证。目前瞬转常用HEK293系统，小规模表达可以获得足够的测试样品，测试需要做好特异性对照。

2.另一种方法是制备小的噬菌体展示库

通过抗原结合可以从中选择功能正确的配对链，需要注意的是与人类序列不同，一些啮齿类动物抗体通过E.coli 表达的scFv或Fab都是无效的。

尽管杂交瘤产生的抗体DNA可能存在显著的内在多样性，但能够明确识别正确功能链的方法是可靠的、可用的和经过充分证明的。考虑到重组抗体在灵敏度和特异性方面的提升，以及重组抗体的重现性，长期稳定的转染表达。因此，使用重组表达抗体无论在科研以及诊断方面都显得非常重要。利用二代测序技术对杂交瘤细胞进行测序，通过对序列信息分析获得不同的抗体重链和轻链的序列，这些候选序列用于抗体配对表达和功能验证，大大地提高了抗体结构优化的效率，增加了获取功能性抗体的可能性。根据序列结果设计特异性引物，对重链和轻链序列进行扩增、设计酶切位点、构建载体和导入大肠杆菌进行单克隆抗体的表达，在抗体的筛选与制备中具有深远的意义。

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参考资料：

[1]Bradbury ARM, Trinklein ND, Thie H, et al. When monoclonal antibodiesare not monospecific: Hybridomas frequently express additionalfunctional variable regions. MAbs. 2018 May/Jun;10(4):539-546.