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支原体qPCR检测不仅用于细胞培养的支原体筛查,也用于生物制品行业的放行检测,但前提是要有方法验证。 无论是否遵循药典,支原体qPCR检测的结果判定都需要一定的标准。下面小编结合德国MB厂家的支原体qPCR说明书及相关文件,给予进一步的阐释。 一、荧光检测通道的结果诠释 用MB公司的qPCR试剂盒检测时,qPCR仪的FAM通道检测支原体荧光信号,HEX通道检测内控对照(简称IC)的荧光信号(如没有HEX通道,可用VIC通道)。IC是用于监测qPCR反应是否正常。对于这两个通道,Ct<40为阳性结果。Ct≥40为阴性结果。支原体DNA和IC存在信号的竞争性抑制。 在阴性对照和阳性对照均结果正常的前提下,根据FAM™通道和HEX通道的检测结果,可判别样品是否有支原体污染。具体见下表: 表1. FAM™通道 (支原体) 和HEX™ (IC) 通道的结果诠释 检测支原体 FAM™通道 内控对照 HEX™通道 结果说明 + +或- 支原体阳性 - - 结果无效,需重新检测 - + 支原体阴性 需要说明的是: 内控对照可在支原体DNA抽提时加入。如果结果无效,则说明抽提失败,或者qPCR存在抑制。如果内控对照是在qPCR反应时加入,则说明qPCR存在抑制。 二、对照与样品的结果诠释(适用于符合EP/JP的检测) 对于遵循EP/JP的检测,具体数据诠释见表2。 样本 结果 意义 进一步的行动 无模板对照 阴性 PCR有效 分析样本数据 阳性 PCR有污染 再重复PCR,检查污染来源(如预混液、水、仪器) 阳性对照 阴性 PCR失败 重复PCR,检查反应失败原因(如漏加试剂、试剂陈旧、加样错误,PCR程序错误) 阳性 PCR有效 分析样本数据 阴性对照 阴性 PCR有效 分析样本数据 阳性 抽提或PCR有污染 重复抽提和PCR,检查污染来源(如缓冲液、预混液、水、仪器),同时,如果无模板对照为阳性,应考虑为PCR污染,应再重复PCR 样本 阴性(0/2) 无污染 生物制品放行 阳性(1/2) 可能有污染 包括抽提在内的全部过程需要重复以评估潜在污染。如果同时无模板对照为阳性,考虑为PCR污染,应再重复实验。模棱两可的结果会影响产品放行。 阳性(2/2) 有污染 生物制品不放行 表2.结果判定的前提是:qPCR检测试剂盒符合EP/JP的要求。 三、MB公司支原体qPCR试剂盒(经典法) 德国MB公司的支原体qPCR检测试剂盒(经典法)(英文名:Venor®Gem qEP)经过厂家全面的方法验证,符合欧洲药典/日本药典要求,适合细胞治疗,CAR-T,抗体药、疫苗等临床项目申报和质检。 需注意样本要先做DNA抽提,再进行qPCR检测。MB还提供用于PCR/qPCR方法验证的配套的支原体10CFU、100CFU菌株标准品、特异性验证用支原体基因组DNA和细菌基因组DNA、支原体DNA绝对定量标准品(基因组拷贝数经严格标定)。 四、德国MB公司介绍 德国MB公司,全称Minerva Biolabs,是世界著名的微生物污染控制公司,成立于1999年,总部位于德国柏林。 公司创始人来自于全球闻名的罗伯特•科赫微生物研究所。 二十年来,MB公司专注于微生物污染检测与清除, 特别是支原体和军团菌的技术和产品,在世界上遥遥领先。 1.自1999年起即研发细胞培养和生物药工业用QC检测试剂 2.配备生物安全二级实验室 3.GMP级洁净车间生产 4.世界最大的支原体PCR检测试剂供应商 5.IOM和PDA成员 6.ISO 9001和ISO 13485认证 注:IOM全称Institute of Medicine PDA全称Parenteral Drug Association |
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