国家纳米科学中心林耀新课题组和王浩课题组：利用智能纳米机器人实现核酸药物肿瘤靶向递送和肿瘤免疫治疗

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导语

核酸药物包括siRNA, ASO和mRNA等，具有治疗传染病、基因疾病、癌症等多种疾病的潜力，已经成为继小分子化药和抗体药物后的第三大类创新药物。2023年诺贝尔生理学或医学奖授予卡塔琳·考里科和德鲁·韦斯曼两位科学家，以表彰他们在mRNA研究上的突破性发现，这些发现助力mRNA疫苗开发及其他医学应用。然而核酸药物体内精确递送一直是影响其体内生物效应的关键核心问题。

纳米结构机器人以其小尺寸、可控的刺激响应性、良好的病灶靶向性和穿透性等特点在疾病诊断和治疗领域受到越来越多的关注。此外，纳米机器人具备执行复杂环境药物传输的能力，包括锚定疾病生物标志物进行富集，根据微环境变化（温度或pH等）可控释放药物等特点。因此，发展智能型纳米机器人，尤其是能够解决核酸药物肝外精确靶向递送问题的技术，将推动更多核酸药物走向临床应用。近日，国家纳米科学中心林耀新研究员和王浩研究员联合团队创新的开发了一种肿瘤微环境响应型智能纳米递送机器，它不仅能够有效负载CpG核酸药物精确递送给TLR9阳性肿瘤以减少毒副风险，并且可以高效调节肿瘤细胞的自噬效应以促使其发生免疫原性死亡实现肿瘤免疫治疗。相关工作以”Engineered CpG-loaded Nanorobots Drive Autophagy-mediated Immunity for TLR9-positive Cancer Therapy” 为题发表在 Advanced Materials（DOI: 10.1002/adma.202306248）。

前沿科研成果

利用智能纳米机器人实现CpG核酸药物肿瘤靶向递送和肿瘤免疫治疗

Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）是先天免疫的关键受体，不仅在先天免疫细胞（B细胞和DC细胞）中高表达，也表达在多种癌症（包括脑、肝、前列腺和卵巢癌）。CpG寡聚脱氧核糖核苷酸（CpG ODN）是Toll样受体9（TLR9）激动剂，能够有效激活免疫应答，通常被用作佐剂在抗感染，抗肿瘤等方面进行研究与应用。然而，在临床实验中发现CpG在一定剂量范围内安全性较好，但是高剂量会引起毒性反应。研究团队基于多年在多肽材料体内精准组装和药物精准靶向递送的研究工作，创新的设计并制备了一种肿瘤靶向型智能纳米递送机器，利用纳米机器人在体内可主动寻靶富集并发生微环境响应等优点有效实现了肿瘤病灶定向核酸药物递送和肿瘤免疫治疗。

图1. 精准递送核酸药物的智能型纳米机器人及其肿瘤治疗示意图（图片来源：Advanced Materials）

研究人员首先采用可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合方法制备了纳米机器人核心元件，嵌段共聚物PHEAm110-b-PMA31和PNIPAAm159-b-PMA31。其中PMA被用作疏水核心以提高纳米机器人的结构稳定性，PHEAm110-b-PMA31通过与富含精氨酸的多肽序列（GRRRDRGRS）共价连接成为荷载CpG寡聚核苷酸的功能单元。此外，为了增加纳米机器人肿瘤靶向和自主执行刺激触发药物释放的功能，将MMP2响应多肽片段（GPLGVRGSn， n = 3、5 和 7）修饰到温敏响应共聚物（PNIPAAm159-b-PMA31）上，通过调节分子结构的亲疏水性控制相转变温度，进而作为开关单元来调节纳米机器人的药物吸附与可控释放。

图2. 纳米机器人的制备示意图（图片来源：Advanced Materials）

为了验证纳米机器人能否特异性的靶向TLR9阳性的肿瘤，研究人员分别选择了TLR9高表达的B16黑色素瘤细胞和低表达的CT26结直肠癌细胞。流式细胞术和荧光共聚焦显微镜成像结果均证明了纳米机器人只能被TLR9阳性的肿瘤细胞高效摄取。细胞毒性实验结果也证明了负载药物的纳米机器人只能选择性杀伤TLR9阳性肿瘤细胞，一旦TLR9表达降低，其特异性的肿瘤杀伤作用也会减弱。接着，研究人员探讨了负载CpG的纳米机器人杀伤TLR9肿瘤细胞的作用机制。最新研究发现，CpG可以通过TLR9信号通路而激活肿瘤细胞的自噬效应。研究团队前期的工作证明肿瘤细胞的自噬效应在肿瘤免疫应答及治疗方面发挥了重要作用（Science Translational Medicine2021, 13 (599), eaba9772, ACS Nano2019, 13 (7), 7568-7577, Nano Letters2019, 19 (5), 2968-2978, Advanced Materials2015, 27 (16), 2627-2634）。通过对比分析联合使用凋亡抑制剂或自噬抑制剂后的细胞死亡情况，研究人员发现只有联用自噬抑制剂后纳米机器人的杀伤能力才大幅降低，说明负载CpG的纳米机器人的确是通过激活TLR9肿瘤细胞的自噬效应进而诱导死亡。自噬介导的细胞死亡往往会伴随着损伤相关分子模式分子（DAMP）的释放，进而增加肿瘤的免疫原性。为了证明这一设想，研究人员观察肿瘤细胞经纳米机器人处理后的DAMPs变化，发现相关指标都有显著提升。此外，当树突状细胞与纳米机器人处理的肿瘤细胞共培养后被强烈的刺激成熟。因此，负载CpG的纳米机器人的确可以选择性地靶向TLR9肿瘤细胞，并诱导发生自噬介导的免疫原性死亡以提高肿瘤的免疫原性。

图3. 载药纳米机器人选择性杀伤TLR9阳性肿瘤细胞（图片来源：Advanced Materials）

为了进一步证实纳米机器人的体内递送和治疗功能，研究人员建立了多种皮下瘤和原位肿瘤模型。结果发现纳米机器人能够精准的将CpG递送给肿瘤，并有效抑制肿瘤生长。通过分析肿瘤微环境中的免疫细胞成分变化，发现只有负载CpG的纳米机器人才能够有效的改善肿瘤免疫抑制微环境，促进效应CD8+ T细胞的数量及浸润。为了验证纳米机器人是通过自噬效应介导了抗肿瘤免疫治疗效果，研究人员联合了自噬抑制剂，结果发现当小鼠肿瘤的自噬效应被抑制，纳米机器人就无法有效地控制肿瘤生长。在治疗挑战性高的CT26结直肠癌原位模型中，纳米机器人不仅表现出优异的肿瘤抑制效果，而且可以产生长效特异的免疫保护应答。在接受纳米机器人治疗后，小鼠体内的Central memory T cell (中央记忆T细胞)显著提高。术后复发模型也证明纳米机器人能够不仅能有效抑制肿瘤生长还能通过激活免疫系统产生长期的保护效果。

图4. 载药纳米机器人通过调控肿瘤细胞自噬效应发挥抗肿瘤功能（图片来源：Advanced Materials）

图5. 载药纳米机器人通过调控肿瘤细胞自噬效应激活肿瘤免疫记忆能力（图片来源：Advanced Materials）

作者最后介绍道，CpG作为在临床前阶段被广泛探索和研究的一款免疫激动剂核酸药物，如果能有效降低其剂量问题带来的毒性，将大大促进其在临床和市场的转化。因此，这种递送CpG的智能纳米机器人对于推动其应用转化具有重要作用。此外，纳米机器人的治疗效果也提示自噬调节药物在肿瘤免疫治疗中的巨大潜力。相关工作以“Engineered CpG-loaded Nanorobots Drive Autophagy-mediated Immunity for TLR9-positive Cancer Therapy”为题发表在Advanced Materials（doi:10.1002/adma.202306248）上，国家纳米科学中心博士毕业生王羿博士和乔圣林博士为第一作者，林耀新研究员、王浩研究员为通讯作者。研究受到国家自然科学基金面上项目（51725302, 51573032, 11621505, 32371458）、科技部重点研发计划（2018YFE0205400, 2022YFA1205700）和京津冀基础研究课题（H2022205047, 22JCZXJC00060, E3B33911DF）的共同资助。

教授简介

林耀新，现任国家纳米科学中心研究员，博士生导师。荣获2021年国家高层次海外引进人才青年项目和中科院高层次人才计划项目。2017年在中国科学院大学，国家纳米科学中心获得博士学位，主要从事“活体自组装”纳米探针和智能纳米药物设计、构建及应用研究。之后在哈佛医学院、布列根妇女医院作为博士后从事mRNA疫苗/药物研究。已在Sci Transl Med, Nat Commun, Adv Mater, Nano Lett, ACS Nano, Nano Today, Small, Biomaterials等国际重要学术期刊上发表SCI论文40余篇，总引用超过8500余次。作为负责人承担了基金委及北京市、广东省等自然科学基金项目多项。

课题组主要结合材料学、免疫学、药学、化学、生物材料以及纳米技术等手段，设计及构筑智能型纳米递送系统，研究纳米材料的生物效应，发展新型抗病毒和肿瘤免疫治疗纳米技术。

研究领域:mRNA递送与疫苗开发；药物递送智能纳米机器及在肿瘤免疫治疗中的应用。

Email：[email protected]

王浩研究员，国家纳米科学中心学术委员会执行委员会委员、学位委员会委员、纳米生物效应与安全性实验室主任。

主要荣誉：国家杰出青年科学基金获得者，国家重点研发计划项目负责人，国家重点研发计划战略国际合作首席科学家，中组部“万人计划”领军人才，科技部中青年科技创新领军人才，中国科学院“百人计划”研究员，中科院交叉创新团队负责人，德国洪堡学者等。

研究领域：纳米生物材料的设计与合成；微流芯片用于纳米材料的初筛和癌症的体外诊断癌症的体外；体内早期诊断纳米技术。

研究成果：聚焦于体内化学自组装新机制和纳米药物研究。提出体内自组装的新理念，实现了材料在病灶部位的靶向、富集和滞留，拓展了新型的医用高分子材料体系，为重大疾病诊疗开辟了新途径。发展了新型多肽聚合物材料的高通量合成新方法；提出了高通量多肽聚合物材料筛选新方法；发展了多肽聚合物材料可控组装新体系；提出了基于多肽聚合物新型材料的诊疗新理念。截止目前为止发表论文160余篇，包括Nat. Nanotech., Sci. Transl. Med., Sci. Adv., Nat. Commun., J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., Adv. Mater.等，出版专著1部，参编5部专著章节，申请美国专利3项，国内专利15项。目前作为项目和课题负责人承担了国家重点基础研究发展计划（973）等。

Email：[email protected]

邀稿

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