转录因子 NAC20 和 NAC26 与 RPBF 相互作用以激活水稻胚乳中的白蛋白积累,Plant Biotechnology Journal

储存在谷物胚乳中的储存蛋白 (SP) 和淀粉是人类食物的最重要来源。根据它们在各种溶剂中的溶解度，SP 分为谷蛋白、谷醇溶蛋白、白蛋白和球蛋白 (Müntz,  1998 )。大多数这些蛋白质由多个基因编码，并通过转录因子 (TF) 的调节特异性沉积在胚乳中（Liu等人，  2022）。其中，白蛋白是最丰富的水溶性蛋白质(Müntz,  1998 )，也是水稻胚乳中最重要的致敏蛋白(Matsuda et al .,  1991 )。因此，了解白蛋白积累的分子机制至关重要。

在玉米中，NAC 转录因子 NAC128/130 调节淀粉和 SP 的积累（Zhang等人，  2019 年）。NAC20和NAC26（以下简称NAC20/26）在发育的水稻胚乳中特异性表达，这两个基因的突变导致粉状胚乳，以及淀粉和 SP 的积累受损（Wang et al. , 2020  ）。在这项研究中，在粳稻品种中华 11（ZH11；图 S1）中产生了一个NAC20 / 26 双敲除突变体，命名为 nac20/26-3，它表现出与报道相似的粉状胚乳表型（ Wang等人， 2020 年；图 S2)。从成熟nac20/26-3胚乳中提取的总蛋白的 SDS-PAGE 分析表明，与 ZH11 相比，16-kDa 条带消失，26-kDa 条带大大减弱（图 1a）。之前的研究表明前者是谷醇溶谷蛋白，后者是α-球蛋白（αGlb; Wang et al .,  2020）。本研究中进行的免疫印迹显示 αGlb 积累显着减少，而谷醇溶蛋白在nac20/26-3中仅略微减少（图 S3），这与 SDS-PAGE 结果不一致（图 1a）。随后，从凝胶中切下的 16-kDa 条带的质谱分析表明，由Os07g11360编码的四种白蛋白的丰度（Alb1 )、Os07g11380 ( Alb2 )、Os07g11330 ( Alb3 ) 和Os07g11410 ( Alb4 ) 在nac20/26-3中急剧下降（表 S1）。使用抗 Albs 抗体的免疫印迹分析证实，白蛋白积聚在nac20/26-3中几乎消失（图 1a）。正如预期的那样，当通过 SDS-PAGE 提取和分析水溶性蛋白质时，在nac20/26-3中几乎检测不到白蛋白条带（图 1b）。对报道的 16-kDa 白蛋白和致敏蛋白的系统分析以及全基因组测序数据表明，水稻中的 16-kDa 白蛋白由五个基因编码，包括Alb1~4和Os07g11510（Alb5；以下简称 Alb1~5；图 S4；Wakasa等人，2011 年；Zhou等人，  2017 年）。qRT-PCR 分析显示Alb1~5的表达在nac20/26 - 3胚乳中显着降低（图 1c），表明 NAC20/26 可能通过转录激活调节水稻胚乳中的白蛋白沉积。

为了确认 NAC20/26 是否直接激活Alb1 ~ 5的表达，通过p35S:NAC20和 p35S:NAC26 的效应构建体和p35S:NAC26的效应构建体以及pAlb1 :LUC、pAlb2:LUC、pAlb3:LUC或pAlb4:LUC或pAlb4:LUC5。结果表明，NAC20/26 激活了Alb1 ~ 5表达，其中 NAC26 比 NAC20 更有效（图 1d；图 S5）。域交换实验以及水稻原生质体中的反式激活测定表明，NAC26 的中间区域，从第 149 位到第 214 位氨基酸 (AA)，归因于其更高的效率（图 1e；图 S6）。CACG 作为 NAC 转录因子的核心结合基序存在于 26-kDa球蛋白、16-kDa谷醇溶蛋白、GluA-1和GluB4/5的启动子区域（Wang等人，  2020 年；图 S7）。在Alb1 ~ 5的 5' 上游序列中鉴定出 CACG 基序（图 S8），其中一些具有保守的侧翼序列（图 S9）。NAC20/26 的绑定到Alb1 ~ 2 5' 上游序列作为代表，通过电泳迁移率变动分析（EMSA；图 1f）确认。作为代表，使用携带覆盖 CACG 基序及其在Alb1启动子中的侧翼核苷酸的单核苷酸取代的探针的竞争测定表明，ACG 对 NAC20/26 结合至关重要（图 S10）。这些结果共同证明 NAC20/26 通过与 ACG 基序结合来调节白蛋白表达。

然后我们使用 NAC20 通过酵母双杂交鉴定相互作用的蛋白质。由于全长 NAC20 在酵母中表现出自动激活，因此选择第 86 到第 320 个 AA 的片段作为诱饵。在鉴定出的 65 个推定相互作用克隆中（表 S2），两个编码的水稻谷醇溶蛋白结合因子 (RPBF) 调节水稻中的淀粉和 SP 积累（Kawakatsu 等人， 2009 年）。在烟叶中进行的萤火虫荧光素酶互补成像 (LCI) 和双分子荧光测定表明 NAC20/26 与 RPBF 相互作用（图 1g；图 S11）。免疫共沉淀 (Co-IP) 分析显示 NAC20 和 NAC26 均沉淀 RPBF（图 1h）。

两个独立的突变等位基因rpbf-1和rpbf-2是通过基因编辑产生的，它们的谷粒如报道的那样表现出皱缩表型（Kawakatsu等人，  2009 年；图 S12）。SDS-PAGE 分析显示，包括白蛋白在内的主要 SP 的强度在其胚乳中降低（图 1i，上图）。使用抗 Albs 的免疫印迹分析证实，与 ZH11 相比， rpbf-1和rpbf-2中的白蛋白积累显着减少（图 1i，中图）。在rpbf-2胚乳中进行的 qRT-PCR 分析证实了Alb1~2的表达（作为代表）显着减少（图 1j），表明 RPBF 通过转录激活调节白蛋白积累。已经表明，RPBF 激活水稻愈伤组织原生质体中的Alb1表达（Yamamoto等，  2006）。尽管在Alb1~5的启动子区域经常发现限制性 RPBF 结合基序 AAAG ，但未发现完整的 P-box (TGTAAAG)（图 S8）。通过效应构建体p35S:RPBF与报告构建体pAlb1:LUC或pAlb2:LUC的成对共转化在幼苗原生质体中进行的双荧光素酶反式激活测定显示 RPBF 激活表达Alb1 ~ 2 (图 1k)。然而，当p35S:RPBF包含在p35S:NAC20与pAlb1:LUC或pAlb2:LUC以及p35S:NAC26与pAlb1:LUC或pAlb2:LUC的反式激活分析中时，观察到反式激活活性增加（图 1l），表明 RPBF可作为 NAC20/26 的辅助因子。在愈伤组织原生质体中观察到的转录活性可能是由NAC20或NAC26的微弱表达或使用的较短启动子序列引起的（Yamamoto等，  2006）。

总之，我们证明 NAC20/26 以不同的效率冗余作用于Alb启动子的 ACG 基序以调节其表达，而 RPBF 作为辅助因子发挥作用以增强 NAC20/26 的转录（图 1m）。据报道，RPBF 通过与 bZIP 型转录因子 RISBZ1 的相互作用来调节水稻胚乳中淀粉和 SP 基因的表达（Kawakatsu 等， 2009  ）。在玉米中，已经表明 PBF 的 RPBF 直向同源物与 bZIP TF O2 相加，调节多个 SP 的表达（Zhang 等人， 2015 年），而 NAC128/130，NAC20/26 的玉米直向同源物，调节SP (Zhang et al .,  2019). 如果 PBF/RPBF 作为一般辅助因子而不是特定的 TF 发挥作用，以协调其他 TF 在谷物胚乳中储存产品积累中的活动，仍有待研究。此外，由于白蛋白是大米中最重要的致敏蛋白（Matsuda等人，  1991 年），这项研究的发现可能为大米消费者提供应对过敏问题的独特途径。

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Storage proteins (SPs) and starch deposited in cereal endosperms are the most important sources of human food. SPs are classified into glutelins, prolamins, albumins and globulins according to their solubility in various solvents (Müntz, 1998). Most of these proteins are encoded by multiple genes and deposited specifically in endosperms through the regulation of transcription factors (TFs) (Liu et al., 2022). Among them, albumin is the most abundant water-soluble protein (Müntz, 1998), and the most important allergenic protein in the rice endosperm (Matsuda et al., 1991). Thus, understanding molecular machinery underlying albumin accumulations is critically important.

In maize, NAC TFs, NAC128/130, regulate starch and SP accumulations (Zhang et al., 2019). NAC20 and NAC26 (NAC20/26 hereafter) are specifically expressed in developing rice endosperm, and mutations of both genes led to floury endosperm, together with compromised accumulations of starch and SP (Wang et al., 2020). In this study, a NAC20/26 double knockout mutant, named nac20/26-3, was generated in a Japonica rice variety Zhonghua 11 (ZH11; Figure S1), which exhibited similar floury endosperm phenotype as reported (Wang et al., 2020; Figure S2). SDS-PAGE analyses of total proteins extracted from mature nac20/26-3 endosperms showed that a 16-kDa band was disappeared, and a 26-kDa band was attenuated greatly when compared with ZH11 (Figure 1a). Previous studies suggest that the former is prolamin, and the latter is α-globulin (αGlb; Wang et al., 2020). Immunoblotting performed in this study showed that αGlb accumulation was significantly reduced, while prolamin was only slightly reduced in nac20/26-3 (Figure S3), which is inconsistent with the SDS-PAGE result (Figure 1a). Subsequently, mass spectrometry analysis of the 16-kDa band excised from gel showed that abundances of four albumins encoded by Os07g11360 (Alb1), Os07g11380 (Alb2), Os07g11330 (Alb3) and Os07g11410 (Alb4) were decreased sharply in nac20/26-3 (Table S1). Immunoblot analysis using anti-Albs antibody confirmed that albumin accumulations were almost disappeared in nac20/26-3 (Figure 1a). As expected, when water-soluble proteins were extracted and analysed by SDS-PAGE, the albumin band was hardly detectable in nac20/26-3 (Figure 1b). Systematic analyses of reported 16-kDa albumins and allergenic proteins, together with whole-genome sequencing data, showed that 16-kDa albumins in rice are encoded by five genes including Alb1~4 and Os07g11510 (Alb5; Alb1~5 hereafter; Figure S4; Wakasa et al., 2011; Zhou et al., 2017). qRT-PCR analyses revealed that expressions of Alb1~5 were decreased dramatically in nac20/26-3 endosperms (Figure 1c), suggesting that NAC20/26 may regulate albumin deposits in rice endosperm through transcriptional activations.