丙酮酸脱氢酶(PDH)

葡萄糖和脂肪酸作为能量来源的使用失调经常见于代谢综合征，如糖尿病和肥胖。此外，癌细胞经常从氧化磷酸化转变为糖酵解来产生ATP。PDH在这些活动中的核心作用引起了人们对了解PDH活动和调节作为潜在治疗工具的新的兴趣。

你选择研究PDH活性的方法取决于实验条件和你要回答的实验问题。

细胞和组织提取物中内源性和磷酸化PDH活性的定量。

测量内源性PDH活性的关键是维持体内磷酸化状态。我们的提取和免疫捕获缓冲液已被配制成抑制特异性和非特异性激酶和磷酸酶，以防止样品制备过程中不必要的PDH修饰。

一旦样品制备完成，就可以在固体表面上使用96孔微孔板格式或试纸分析格式对活性酶进行免疫捕获和分析。这种方法比使用[14C]丙酮酸和测量酶催化释放[14C]CO2的经典方法更简单、更快和更安全。

PDH活性也可以在体外分析后，PDH免疫捕获和去除内源性激酶和磷酸酶。然后用重组PDK磷酸化样品或用重组PDP去磷酸化样品，以确定(a)完全磷酸化的PDH的剩余活性，(b)完全去磷酸化酶的最大活性和(c)内源性未修饰的PDH活性。

活细胞或细胞和组织提取物中总PDH和磷酸化PDH的定量

PDH的关键调节亚基是e1 - α亚基(PDH1)，在三个丝氨酸磷酸化位点被激酶修饰以降低活性。

总PDH e1 - α和修饰的磷酸化丝氨酸(Ser232, Ser293和Ser300)的定量可以很容易地使用夹心ELISA分析。这种方法测量蛋白质和磷酸化水平，无论它们是内源性的还是药物治疗的结果。

细胞内ELISA (ICE)分析可用于测量培养活细胞中翻译后修饰的蛋白质水平。ICE方法的好处是在96孔或384孔板中快速固定细胞，原位稳定酶磷酸化，并消除样品制备过程中可能发生的任何变化。

用western blot、流式细胞术或免疫细胞化学分析活细胞或细胞和组织提取物中的PDH亚基

PDH复合物缺陷是乳酸性酸中毒的重要原因，可引起儿童利氏病。大多数PDH缺乏病例是由于x -连锁e1 - α亚基的突变，尽管其他亚基的突变也有报道。

我们的抗体已经通过免疫沉淀、western blot、免疫细胞化学(ICC)和ELISA试验的组合检测了靶点特异性。