颠覆现有认知，自复制RNA也可掺入修饰核苷，降低免疫原性，增强蛋白表达

筛选增强自复制 RNA 表达的修饰核苷酸

他们采用 27 种修饰核苷酸，合成 mcherry-saRNA，利用阳离子脂质转染 HEK293 细胞，以荧光蛋白信号作为转染效率的评估指标，筛选到 3 种转染效率最高的修饰核苷酸，分别是 5-羟甲基胞苷(5OHmC)、5-甲基胞苷(5mC)及 5-甲基尿苷(5mU)。与 N1mΨ-mcherry-saRNA 相比，转染效率分别提升 14 倍、10 倍及 8 倍。与未修饰的 WT-mcherry-saRNA 相比，筛选出的 3 中修饰核苷的转染效率也有显著提升或者相当。此外，我们可以明显看到，与未修饰的 WT-mcherry-saRNA 相比，一旦使用 N1mΨ，会导致 mcherry-saRNA 的转染效率坠崖式下降。

帽结构类型的影响

使用修饰核苷酸替换对应的天然核苷酸，同时，采用 GAU 合成携带 Cap1 帽结构的自复制 RNA 转染效率或者蛋白表达水平显然要比采用 ARCA 合成的携带 Cap0 帽结构的自复制 RNA 更高。

修饰自复制 RNA 表达活性的增强可在多种类型细胞中重现

使用 SM102 LNP，递送 10 ng Luc-saRNA 至各种不同类型细胞中。与未修饰的 Luc-saRNA相比，使用 5mC-Luc-saRNA 蛋白表达水平或者转染效率会提升数倍，与 N1-甲基假尿苷修饰的 Luc-saRNA 相比，更是可提升至数百倍。此外，5mC-Luc-saRNA 在细胞中的蛋白表达水平的增强可持续长时间。

使用修饰核苷酸降低自复制 RNA 触发的干扰素反应

细胞内有许多可识别外源 RNA 的模式识别受体，有些位于膜上，例如，TLR3/7/8，有些位于细胞质中，例如，识别双链和 5'-三磷酸修饰 RNA 的胞质受体 RIG-I 和 MDA-5 等。这些模式识别受体与外源 RNA 相结合会触发下游干扰素信号通路，激活天然免疫反应。外源 mRNA 的免疫原性是一把双刃剑，一方面可起到佐剂作用，另一方面，过强的天然免疫信号会导致RNA降解，抑制蛋白质合成。使用修饰核苷酸降低外源 mRNA 的免疫原性是 mRNA 技术应用过程中的里程碑事件，对此，我们也曾经专门介绍过（回溯|N1- Methyl-Pseudouridine破除Moderna公司前进障碍），当前，N1mΨ是常规线性 mRNA 疫苗及药物使用最为广泛的修饰核苷酸。

在外周血单核细胞（PBMC）中，相比未修饰的 saRNA，用 5OHmC 或者 5mC 修饰核苷酸完全替换相应的天然核苷酸会大大减少 saRNA 诱导的干扰素基因的表达。

评估自复制 RNA 疫苗的体内免疫效果

构建编码 Spike 蛋白的自复制 RNA，转染细胞。在 HEK 细胞中，相比未修饰的 Spike-saRNA 相比，5OHmC/5mC 及/5mU-Spike-saRNA 蛋白表达量增加 2 倍多。在 C212 细胞中，相比未修饰的 Spike-saRNA 或者 N1mΨ-Spike-saRNA，5OHmC 和 5mC-Spike-saRNA 蛋白表达量分别可提升 2 倍和 8 倍。有意思的是，5mU-Spike-saRNA 在 C212 细胞中并未观察到蛋白表达量的显著提升。类似的是，5mU-HA-saRNA 转染 C212 细胞，同样也未表现出蛋白表达的增强。

在小鼠体内注射 2.5μg Luc-N1mΨ-mRNA 或者 Luc-5mC-saRNA，观察自复制 RNA 的表达动力学特征。结果发现，Luc-5mC-saRNA 在注射后长时间内均能保持高水平蛋白表达，相反， Luc-N1mΨ-mRNA 在注射后 24 小时蛋白表达量迅速抵达峰值，随后，表达量随着时间增加而持续走低。

在小鼠体内注射 Spike-saRNA 疫苗，评估免疫效果。在免疫注射 24h 时，与 Spike-5mC-saRNA 疫苗或者 Spike-N1mΨ-mRNA 疫苗免疫小鼠相比，未修饰的 Spike-saRNA 疫苗免疫小鼠血清中明显检测到更高水平的 IFN-α1，但是，在免疫注射 48h 时，所有免疫小鼠血清中均检测不到 IFN-α1。在攻毒试验中，注射 100ng 或者 1000ng Spike-5mC-saRNA 疫苗或者未修饰的 Spike-saRNA 疫苗的小鼠存活率为 100%，体重减低也最少的。注射 10ng 的未修饰Spike-saRNA 疫苗的小鼠体重下降严重，致死率为50%，相反，注射 10ng Spike-5mC-saRNA 疫苗的小鼠致死率仅为10%。此外，我们还可以观察到，虽然 Spike-N1mΨ-mRNA 疫苗免疫小鼠所需的注射剂量为 1000ng，但是，小鼠体重不会发生下降，存活率为 100%，免疫效果是最好的。

结论

大量的研究表明使用修饰核苷酸降低外源合成 mRNA 的免疫原性对于常规线性 mRNA 来说是具有通用性的，但是，在自复制 RNA 和 circRNA 领域的应用中遭遇到意想不到的阻碍。很长时间内，不同课题组的研究结果均显示在自复制 RNA 或者 circRNA 合成中一旦使用 N1mΨ会直接丧失蛋白表达活性。Grinstaff Lab 这项工作直接颠覆了先前的认知，自复制 RNA 和 circRNA 序列中仍然是可以掺入修饰核苷酸替代天然核苷酸，降低免疫原性，提升蛋白表达。先前那些吊诡的研究结果只是因为并未找到与 saRNA 或者 circRNA 序列相兼容的修饰核苷。当然，后续还需要对不同修饰核苷酸影响saRNA或者circRNA表达活性的机制做出更加深入的研究，比如，为什么有的修饰核苷酸酸在不同的细胞类型中对于saRNA免疫原性或者蛋白表达活性的影响是不同的？为什么修饰嘌呤核苷无法降低saRNA免疫原性？

一周前，VLP Therapeutics公司创始人 Wataru Akahata团队在 medrxiv 上传文章：Safety and immunogenicity of VLPCOV-02, a SARS-CoV-2 self-amplifying RNA vaccine with a modified base, 5-methylcytosine, in healthy individuals，他们在自复制 RNA 疫苗中掺入了修饰核苷 5-甲基胞嘧啶以减少先天反应，降低反应原性。在临床 1 期剂量递增研究中，接种 1、3、7.5 及 15 ug 5-甲基胞嘧啶修饰的自复制 RNA 新冠疫苗的免疫者血清中的抗体滴度在第 28 天会增加 3 倍左右，证实了修饰自复制 RNA 临床应用的安全性和有效性。

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