索拉非尼的工艺优化及其衍生物的设计,合成与抗肿瘤活性研究

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作者：

王敏

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摘要：

索拉非尼(Sorafenib,商品名Nexavar)是由拜耳和Onyx药业联合开发的第一个多靶点抗肿瘤药物,美国食品药品局(FDA)批准作为治疗晚期肾癌的一线药物于2005年12月上市,它是一种新型的双芳基脲类衍生物,既可以抑制Ras/Raf/MEK信号转导通路,同时还可以抑制VEGFR和PDGFR等受体蛋白而阻断新生血管的形成,从而抑制肿瘤细胞的生长.本论文介绍了酪氨酸激酶及与其相关的信号转导途径,阐述了近年来索拉非尼的合成研究历程,在此基础上,选择合适路线进行工艺优化并开展了新型索拉非尼衍生物的设计,合成及抗肿瘤活性研究.本文首先主要对索拉非尼的合成工艺进行了优化,在已有文献的基础上,选择了最佳合成路线,以2-吡啶甲酸为起始原料,经卤化,酰胺化,成醚制得中间体N-甲基-4-(4-硝基苯氧基)吡啶-2-甲酰胺,经过还原得到关键中间体N-甲基-4-(4-氨基苯氧基)吡啶-2-甲酰胺(1),4-氯-3-(三氟甲基)苯胺与光气反应得到异氰酸酯,再与关键中间体(1)形成目标化合物索拉非尼;其总收率为50.4%.本文改进后的合成方法具有原料廉价易得,步骤较少,操作简单,条件比较温和,收率较高以及对环境污染小等特点,更利于工业化生产.同时,以索拉非尼(Sorafenib)为先导化合物,总结文献报道的索拉非尼及其类似物的构效关系,分析其与作用靶点的结合特点,在实验室前期研究的基础上,保留N-甲基-4-苯氧基吡啶-2-甲酰胺这一重要的药效团结构,考察另一活性药效团脲结构被结构类似片段替换后抗肿瘤活性的变化;根据文献可知,查耳酮结构为很好的迈克尔受体,可以和多个受体氨基酸残基结合,从而有较好的抗菌,抗病毒,抗肿瘤活性,为活性药效团,目前有研究者将此基团引入VEGFR-2激酶抑制剂抗肿瘤活性良好,因此,我们引入查耳酮药效团,替换双芳基脲,同时为了考察查耳酮双键位置对化合物活性的影响,设计合成W1系列共20个化合物;为了让设计的索拉非尼衍生物与受体结合更加吻合,拟在α,β-不饱和醛酮位置增加氮原子,在查阅文献的基础上得知,含吡唑结构的化合物广泛的应用于食品,农药,抗菌,抗肿瘤等领域,而且抗肿瘤活性良好,因此在查耳酮类衍生物的基础上,分别将上述化合物与水合肼反应,构建吡唑活性药效团,同样为了考察吡唑结构碳氮双键位置对化合物活性的影响,设计合成W2系列共17个化合物;其次在吡唑结构基础之上,碳氮单键处引入硫代酰胺结构,进而设计合成W3系列共6个化合物;据文献报道含1,2,3-三唑结构被广泛用作抗癌剂的设计,而且表现出较好的抗肿瘤活性,因此1,2,3-三唑-苯基-4-甲酰胺-5-三氟甲基(甲基)结构替代脲结构,设计出6个W4系列的化合物;通过生物电子等排,哒嗪酮结构替代1,2,3-三唑,考察其抗肿瘤活性,设计出含4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-苯基-5-甲酰胺结构的6个W5系列化合物,所合成55个均未见文献报道的化合物,其结构经MS和~1H-NMR确证.采用MTT法,以人肺癌细胞A549,人肝癌细胞HepG2,人乳腺癌细胞MCF-7和人前列腺癌细胞PC-3为测试细胞株,索拉非尼为阳性对照药,对所合成的五系列共55个化合物进行了体外抗肿瘤活性测试.结果表明:有19个化合物对一株或者多株肿瘤细胞显示出较好的抑制活性,优于索拉非尼或与其相当.其中化合物WM-3对HepG2细胞的抗肿瘤活性(IC_(50):0.56±0.83μM)是对Sorafenib(IC_(50):3.44±1.50μM)的6.14倍,其中化合物WM-22表现出对各细胞很强的抗肿瘤活性,对A549,HepG2和MCF-7的(IC_(50):2.84±0.78μM,1.85±1.03μM和1.96±1.28μM)是索拉非尼(2.92±0.68μM,3.44±1.50μM,3.18±1.43μM)的1.02到1.86倍.本论文采用MTT法考察了WM-22对A549细胞的生长抑制作用.为考察其酶抑制活性,采用LANCE~?Ultra酶活性评价法,以索拉非尼作为阳性对照药,分别对10个活性优异的化合物(WM-2,WM-3,WM-9,WM-17,WM-22,WM-28,WM-29,WM-35,WM-41和WM-43)进行了VEGFR-2/KDR和B-Raf酶抑制活性测试.结果显示WM-2和WM-22对VEGFR-2/KDR酶的抑制活性与索拉非尼相近,说明所设计的W1和W3系列化合物是潜在的VEGFR-2/KDR激酶抑制剂.在W1系列化合物中,吸电子基团[3-Br(WM-2),4-F(WM-17)]和供电子基团(C-3,4,5或者C-2,3,4)取代有利于化合物活性的提升;在W2和W3系列化合物,取代基3-Br和无取代基对化合物的活性有一定的提升;在W5系列化合物中,苯环邻位有吸电子基团(-F)可以提升化合物的活性.为了进一步探究靶点与VEGFR-2/KDR激酶相互作用关系,通过计算机辅助药物设计软件中的分子对接模块,同样发现引入查耳酮和吡唑结构对化合物的活性有所提高,而且部分化合物活性和阳性对照药索拉菲尼相当或优于索拉菲尼.为了探索化合物的作用机制,观察细胞给药后,细胞形态的变化,采用吖啶橙(AO)单染,荧光显微镜下观察细胞形态变化,发现WM-22化合物有诱导肿瘤细胞凋亡的作用;也采用Annexin V-FITC/PI流式细胞术进行细胞凋亡测定,目标化合物WM-22可以浓度依赖性地诱导细胞凋亡.综上所述,本课题在索拉非尼工艺优化的基础上,设计,合成和筛选得到一系列具有较强抗肿瘤活性的含查尔酮,吡唑,三氮唑和哒嗪酮结构的索拉非尼衍生物,对该类索拉非尼衍生物构效关系的分析为后期研究提供了优化,改造思路,指明了研究方向.

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年份：

2017