免疫沉淀试剂盒(Protein G磁珠法)(P2177M)

碧云天生产的免疫沉淀试剂盒(Protein G磁珠法) (Immunoprecipitation Kit with Protein G Magnetic Beads)是一种通过高质量的重组Protein G磁珠，配合用户自备的特异性抗体，进行目的蛋白免疫沉淀或免疫共沉淀的试剂盒。本产品的免疫沉淀产物，可以用于目的蛋白或其蛋白复合物组分的检测。

本试剂盒包含高质量的Protein G磁珠及经过优化验证的免疫沉淀必要试剂，使免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP，也称Pull-down)或免疫共沉淀(Co-IP)实验更加简单、便捷、高效，配合特异性抗体，广泛用于目的蛋白或其蛋白复合物的免疫沉淀、免疫共沉淀或纯化等实验。

免疫沉淀或免疫共沉淀是研究蛋白或蛋白与蛋白相互作用(Protein-Protein Interactions, PPIs)的常用实验技术，通过使用特异性抗体和可结合抗体的介质(如Protein A/G Agarose或Protein A/G磁珠)，或直接使用偶联特异性抗体的介质(如琼脂糖凝胶或磁珠)，然后通过离心或磁力从溶液中分离出抗原和抗体复合物，从而将目标蛋白质从复杂样品中分离出来，随后可以用于Western印迹检测或质谱分析等。

Protein G是C型或G型链球菌(Streptococcal bacteria)表达的免疫球蛋白结合蛋白；Protein A是一种发现于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁表面蛋白，分子量为42kDa。Protein G和Protein A功能相似，能特异性地与哺乳动物免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)结合，结合的部位通常为免疫球蛋白的Fc区，但有资料显示Protein A也会和人VH3家族的Fab区结合，而Protein G有时与Fab区也有一定结合。同时，两者对于不同的免疫球蛋白亚类的结合能力有所不同。适当重组改造的Protein A、G与磁珠以一定的方式结合，可用于免疫沉淀或抗体的纯化。

Protein G磁珠适合于免疫沉淀human IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，mouse IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，rat IgG1、IgG2a、IgG2b、 IgG2c，以及rabbit、goat多克隆抗体；而Protein A磁珠适合于免疫沉淀human IgG1、IgG2、IgG4，mouse IgG2a、IgG2b及rabbit IgG等。下表是碧云天Protein A、Protein G、Protein A/G磁珠产品与人、小鼠、大鼠常见的免疫球蛋白亚类的结合能力及不同物种的总结合能力情况表。

本产品中的重组Protein G可与多数哺乳动物IgG的Fc端特异性结合，分子量约为25kDa。该重组Protein G通过改造，仅保留了与IgG Fc端结合相关的氨基酸序列，去除了结合位点以外可能导致非特异性结合的序列，从而可以有效减少非特异性结合。本产品的每个Protein G分子可以结合3个IgG分子。

本试剂盒包含高质量的BeyoMag™ Protein G磁珠、Normal Mouse IgG和Normal Rabbit (正常小鼠IgG和兔IgG，作为阴性对照)及优化的各种缓冲液如Lysis Buffer、TBS (10X)、Protease Inhibitor Cocktail (100X)、Acid Elution Buffer、Neutralization Buffer、SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5X)等免疫沉淀必要试剂，使免疫沉淀或免疫共沉淀实验更加简单、便捷、高效。本试剂盒进行免疫沉淀的流程参考图1。BeyoMag™ Protein G磁珠经适当洗涤后，加入一定量特异性抗体，Protein G可与抗体Fc端特异性结合，一定时间孵育后形成Protein G磁珠-抗体混合物(beads-Ab complex)，然后加入样品，样品可被抗体的Fab端特异性识别而形成Protein G磁珠-抗体-抗原免疫复合物(beads-Ab-Ag complex)。洗涤免疫复合物以去除未结合的蛋白，然后使用酸性洗脱液或SDS-PAGE上样缓冲液等方法从磁珠上洗脱结合的免疫复合物用于后续检测。

图1. 碧云天免疫沉淀试剂盒(Protein G磁珠法)的免疫沉淀流程图。

本试剂盒中的BeyoMag™ Protein G磁珠，也被称为Protein G Magnetic Beads，可以特异性地结合相关抗体，并可以借助磁力架等磁分离设备非常便捷地应用于目的蛋白或其蛋白复合物的免疫沉淀或纯化等实验。其特点有：(1)特异性强、靶蛋白结合量高，磁珠含量达10mg/ml。传统的Protein G琼脂糖凝胶孔径大，容易产生非特异吸附，而本产品磁珠粒径小，不易产生非特异吸附。本产品每毫升磁珠悬浊液含约10mg磁珠，含有不少于0.6mg重组Protein G，每个重组Protein G具有3个Fc结合域，通常可结合不少于0.7mg人IgG(具体的最大结合量和抗体类型及目的蛋白等相关)。每500微升样品，通常仅需使用10-20微升磁珠悬浊液，就可以高效地进行免疫沉淀实验。(2)本产品结合抗体或抗体复合物的速度快：本产品所使用的纳米级磁珠(~200nm)具有超大比表面积，便于磁珠与抗体或抗体复合物的快速有效结合。通常10分钟内即可完成抗体或其复合物的吸附的过程，30分钟内完成目的蛋白免疫沉淀操作。缩短操作时间可以有效避免在长时间操作过程中目的蛋白的降解或变性，充分保证目的蛋白的活性。由于采用磁性分离，每次进行IP和Co-IP相比于琼脂糖凝胶可以节省40%的时间。

本试剂盒中BeyoMag™ Protein G磁珠的主要指标如下表：

本试剂盒提供两种洗脱方法。根据抗体复合物中目的蛋白的结构、生物学功能及后续应用的要求等，本试剂盒提供两种洗脱方法，包括酸性溶液和SDS-PAGE上样缓冲液。如有相应的竞争性多肽，也可自行使用该竞争性多肽进行洗脱。本产品用于GFP-Flag融合蛋白的免疫沉淀效果参考图2。

图2.碧云天免疫沉淀试剂盒(Protein G磁珠法)用于GFP-Flag融合蛋白的免疫沉淀效果图。293T细胞(人胚肾细胞)转染GFP-Flag质粒36小时后，经Lysis Buffer裂解。样品1为Input，即全细胞裂解液(total cell lysate)；样品2、3和4都为本试剂盒中Protein G磁珠免疫沉淀后的样品，其中样品2中使用的是Normal Mouse IgG (正常的小鼠IgG)免疫沉淀后经SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)洗脱后得到的样品，为阴性对照；样品3和4进行IP时使用的都是Flag抗体(AF519)，其中样品3使用SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)洗脱，样品4使用3X Flag多肽(P9801)洗脱。使用SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)洗脱后可以检测到Flag抗体的轻重链，而使用3X Flag Peptide洗脱仅含有GFP-Flag，整个泳道仅检测到单一的目的条带。Western印迹成像由BeyoImager™ 600化学发光成像系统完成(EI600)。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

对于常规的免疫沉淀实验，按照每500μl样品使用20μl磁珠悬浊液，本试剂盒小包装P2177S和中包装P2177M分别可以进行20次和100次样品的免疫沉淀，同时分别可以进行4个和20个阴性对照的免疫沉淀；按照每100μl样品使用4μl磁珠悬浊液，则分别可以进行100次和500次样品的免疫沉淀，同时分别可以进行20个和100个阴性对照的免疫沉淀。

-20℃保存，一年有效。P2177-4 BeyoMag™ Protein G Magnetic Beads可以4℃保存。

需自备磁分离架，推荐使用碧云天的1.5/2ml磁分离架(FMS004、FMS008、FMS012、FMS016、FMS024)。

如果免疫沉淀的目的蛋白涉及磷酸化修饰或者乙酰化修饰，需要自备相应的磷酸酶抑制剂和去乙酰化酶抑制剂。推荐选购碧云天的磷酸酶抑制剂混合物A (50X) (P1081/P1082)和去乙酰化酶抑制剂混合物(100X) (P1112/P1113)。

本试剂盒提供的Lysis Buffer经反复测试，适合很多情况下的免疫沉淀或免疫共沉淀时的样品裂解和后续的洗涤。但由于免疫沉淀或免疫共沉淀蛋白样品的复杂性和特殊性，本Lysis Buffer不一定适合所有免疫沉淀样品的裂解与洗涤。在使用本试剂盒提供的Lysis Buffer效果欠佳的情况下，需要自行对于裂解液和洗涤液进行摸索和调整。此时建议根据文献自行配制裂解液和洗涤液，或尝试碧云天的其它适当裂解液：https://www.beyotime.com/support/lysis-buffer.htm。

BeyoMag™系列磁珠经测试，反复冻融3次以上，不影响使用效果。

BeyoMag™ Magnetic Beads需维持pH为6-8，避免高速离心、干燥或冻存；请勿长时间将磁珠置于磁场中，否则可能会引起磁珠聚团。

BeyoMag™ Magnetic Beads使用前要适当充分重悬，即颠倒若干次使磁珠混合均匀，混匀操作须轻柔，不宜剧烈涡旋震荡等，避免抗体变性等。

在免疫沉淀时，建议使用抗体种属相同的正常IgG配制相同稀释比或终浓度的正常IgG工作液，以用于去除非特异性结合或作为阴性对照。本试剂盒中提供适量Normal Mouse IgG和Normal Rabbit IgG，更多需求，可以订购碧云天的人IgG (A7001)、山羊IgG (A7007)、兔IgG (A7016)、小鼠IgG (A7028)、大鼠IgG (A7031)、驴IgG (A7039) 。

蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4℃或冰浴，以减缓蛋白降解或变性。

如果使用真空泵等仪器吸取上清液，须注意真空泵的吸液强度，以免吸力过大而吸取到聚集的磁珠。

酸性溶液洗脱时磁珠可能会发生聚集，属于正常现象，不影响磁珠的正常使用。0.1%的非离子型去垢剂(如Triton X-100、Tween-20或NP-40)可有效防止磁珠聚集，并且不会影响磁珠的抗体结合效率。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。