山茱萸药材加工过程废弃物制备木醋液的化学成分分析及抑菌活性评价

1.1.1山茱萸果核山茱萸果核由河南宛西制药股份有限公司提供。2020 年11 月采自河南省南阳市西峡县米坪镇，经南京中医药大学段金廒教授鉴定为山茱萸科植物山茱萸C. officinalis Sieb. et Zucc 的成熟果核，样品采集后自然风干。

1.1 .2供试菌种大肠杆菌Escherichia coli （CICC20658）、痢疾志贺氏菌Shigella dysenteriae （CICC23829）、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus（ATCC25923），购于广东省微生物菌种保藏中心。

1.2 仪器与试剂

HZ01 型干馏釜（溧阳市海佐机械制造有限公司），DHG-9023 型鼓风干燥培养箱（太仓市华利达实验设备有限公司），UV-5100 型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司），Quitix125D 型电子天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司），IS-RDV1 型恒温振荡器（美国精骐有限公司），LRH-150 型液晶生化培养箱（太仓市华利达实验设备有限公司），S-B50L 型立式压力蒸汽灭菌器（江苏省金坛市医疗器械厂），超净工作台（苏州净化设备有限公司），气相色谱- 四极杆串联质谱仪（ClarusSQ 8T ，美国PerkinElmer 公司）。

2 方法与结果

2.1 山茱萸果核木醋液制备与精制

称取795 g 山茱萸果核粉末（40 目筛）置于密闭式干馏釜中，以5 ℃/min 的升温速率将材料从室温升至目标温度600 ℃，到达温度后保温30min 。在冷凝装置中通入冷却水，冷凝干馏时产生的气体，从开始馏出液体时记录为初始温度（306 ℃），温度每升高50 ℃收集1 次馏份，共收集到6 份馏出液。参照枣核木醋液制备方法[14]，将收集的馏出液放入4 ℃冰箱静置30 d ，木醋液分离为3 层，上层为少量油状物，中层为澄清木醋液，下层为粘稠的木焦油等，采用虹吸法获取中层的木醋液，加入5% 粉末状活性炭，常温下恒温振摇器振摇1 h （300 r/min ），静置3 d ，抽滤，得精制山茱萸果核木醋液。不同热解温度木醋液产量及精制得率见表1 。

由表1 可知，山茱萸果核木醋液以高于406 ℃为主要馏出温度段。精制处理后各热解温度木醋液的得率随热解温度的升高而降低，这是由于随着温度的升高，木醋液中木焦油的含量也越高，经过精制后，木焦油被除去，故得率降低。因热解温度306 ～356 ℃所得木醋液（W 306 ～356 ）产量较低，难以进行后续实验，故将其与热解温度356 ～406℃所得木醋液（W 356～406）合并。

2.2 山茱萸果核木醋液组成成分分析

2.2.1GC-MS 定性分析条件色谱条件：色谱柱为DB-FFAP 毛细管柱（30 m ×0.25 mm ×0.25 μm ），进样口温度为250 ℃，进样量为0.5 μL ，采用分流进样，分流比为30 ∶1 ，氦气作为载气，体积流量1.00 mL/min；柱温60 ℃，恒温3 min后，以5℃/ min的速率升温至240 ℃，恒温10 min 。

质谱条件：EI 源，电子能量70 eV ，离子源温度150 ℃，传输线温度200 ℃，质量扫描范围为m / z 35 ～400 ，溶剂延迟2 min 。质谱标准库：NIST17 。

2.2.2保留指数（retention index ，RI ）的测定取正构烷烃混合对照品（C 7 ～C 40 ）0.1 mL 溶于1 mL 醋酸乙酯，取适量备用，按照2.2.1 项下色谱条件进行分析，记录保留时间，运用单一线性升温公式（1 ）计算各待测化合物的RI [15]。

RI＝100 n ＋100[ t r( x ) －tr( n )]/[ t r( n ＋1)－tr( n )] （1）

tr代表保留时间，x表示待分析化合物，n和n＋1分别表示正构烷烃的碳原子数。且tr( n ) ＜tr( x ) ＜tr( n ＋1)

2.2.3样品溶液制备及分析测定分别精密量取各精制木醋液1 mL 置于5 mL 具塞玻璃试管中，精密加入2 mL 醋酸乙酯振摇萃取，4 ℃静置过夜，取上层醋酸乙酯萃取液，按上述试验方法和条件进行GC-MS 分析，获得不同热解温度山茱萸果核木醋液GC-MS 总离子流图（图1 ）。

按上述GC-MS 条件测定，5 个热解温度山茱萸果核木醋液挥发性成分的总离子流图如图1 所示，除W 306～406所检测到成分较少外，其余热解温度木醋液所含成分较为相似，但其相对含量有所差异。所有色谱峰信息依据NIST17 标准谱库检索和人工解析，从匹配度、质谱图相似度等方面比较，计算待测组分的RI ，与NISTChemistry WebBook 数据库中保留指数文献值（RI * ）对比进行定性，确定物质种类，并根据峰面积归一化法确定物质的相对含量，结果见表2 。在5 个热解温度所得木醋液样品中分别鉴定出22 、47 、57 、62 、60 种组分。其中共有组分主要为有机酸类、酚类、醛类和酮类，有机酸类主要包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、正戊酸等；酚类主要包括愈创木酚、苯酚等；醛类主要包括糠醛和5-羟甲基糠醛等；酮类主要包括乙酰氧基-2-丙酮、2,5-己二酮等。采用面积归一化法计算由低至高5个不同热解温度木醋液中共有组分相对含量，结果显示，总有机酸相对含量分别为24.09%、51.18%、54.82%、66.82%和67.04%；总醛类相对含量分别为65.38%、24.41%、12.11%、5.33%和3.26%；总酚类相对含量分别为1.69%、3.82%、5.75%、5.28%和7.37%。总酮类相对含量分别为6.16%、5.59%、4.84%、3.84%和4.18%。此外尚有少量的醇类、酯类、烷类和含氮类化合物。

2.3 主要成分的含量测定

通过GC-MS 分析W 506～556鉴定出62 种化合物，根据峰面积筛选出相对含量较高的前10 种化合物乙酸、糠醛、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸、正戊酸、愈创木酚、甲基环戊烯醇酮、2,6- 二甲氧基苯酚，以该10 种成分作为主要成分对不同解热温度山茱萸果核木醋液进行定量分析。

2.3.1内标溶液的制备精密取水杨酸甲酯20.80 mg ，置于10 mL 量瓶中，加醋酸乙酯溶解并稀释至刻度，摇匀即得。

2.3.2供试品溶液的制备精密量取各精制木醋液1 mL 置于5 mL 具塞玻璃试管中，精密加入2 mL 醋酸乙酯振摇萃取，4 ℃静置过夜，取上层醋酸乙酯萃取液，即得供试品溶液。

2.3.3对照品储备液制备取适量对照品，精密称定，置于10 mL 量瓶中，加醋酸乙酯溶解并稀释至刻度，配制成质量浓度分别为乙酸54.29mg/mL 、丙酸46.27 mg/mL 、异丁酸54.87 mg/mL 、丁酸50.38 mg/mL 、正戊酸42.02 mg/mL 、异戊酸41.36 mg/mL 、糠醛25.81 mg/mL 、愈创木酚4.65 mg/mL 、甲基环戊烯醇酮8.47 mg/mL 和2,6- 二甲氧基苯酚4.54 mg/mL 的混合对照品储备液。继以醋酸乙酯分别等比稀释2 、4 、8 、16 、32 、64 、128 倍，即得不同质量浓度的混合对照品溶液。

2.4 方法学考察

2.4 .1线性关系考察分别精密量取适量混合对照品溶液，置于10 mL量瓶中，分别精密加入内标溶液1 mL，再加醋酸乙酯稀释至刻度，摇匀。以各待测化合物与内标的峰面积比值为纵坐标（y），各待测化合物质量浓度为横坐标（x），进行线性回归，得回归方程。各化合物线性关系考察，结果见表3。各化合物R2在0.992 3～0.9993，表明线性良好。

2.4.2精密度试验取“2.3.3 ”项下方法制备的混合对照品储备液，连续进样6 次，按照“2.2.1 ”项下及表3 中定量离子条件测定，结果表明，10 种待测成分的质量分数RSD 值均小于1.48% ，说明仪器的精密度良好。

2.4.3重复性试验按“2.3.2 ”项下方法制备供试品溶液6 份，按“2.2.1 ”项下色谱、质谱条件分别进样，结果表明，按表3 中定量离子进行分析，10 种待测成分质量分数的RSD 值均小于1.36% ，表明方法的重复性良好。

2.4.4稳定性试验取供试品溶液，依据“2.2.2 ”项下色谱及质谱条件在0 、1 、2 、4 、6 、8 h 取样测定，结果表明，10 种待测成分质量分数的RSD 值均小于1.78% ，表明供试品溶液在8 h 内稳定。

2.4.5加样回收率试验取已测定的木醋液样品，分别加入适量对照品溶液，进样测定，计算各被测成分的加样回收率和RSD 值，结果见表3 ，10 种对照品的平均回收率在97.39% ～102.13% ，RSD 值均小于2.14% ，表明方法的准确性较好。

2.4.6样品含量测定取各解热温度木醋液3 份，按“2.3.2 ”项下方法制备供试品溶液，取100 μL 供试品溶液加入100 μL 内标溶液，混匀，按上述实验条件进行测定，进样量为0.5 μL ，分流比为30 ∶1 。混合对照品及样品的GC-MS 总离子流图见图2 。记录峰面积，以各化合物与内标的峰面积比值按内标法计算样品质量浓度，结果见表4 。

由表4 可知，除糠醛外，其余9 种成分质量浓度均随热解温度的升高呈先升高后降低的趋势，而糠醛质量浓度随温度升高呈降低趋势。9 种成分均在W 506～556中达到最高，6种有机酸类物质总质量浓度为209.14 mg/mL，约占该木醋液样品总质量的20%，其中丙酸质量浓度最高，达45.07 mg/mL。

2.5 抑菌活性及相关性分析

2.5.1抑菌圈直径的测定采用滤纸片法测定不同热解温度所得山茱萸核木醋液对大肠杆菌、痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径。分别用接种环刮取已活化好的大肠杆菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌单菌落，接种于Luria-Bertani （LB ）液体培养基中，于37 ℃振荡培养12 h ，通过测量吸光度（A ）值，用无菌水制成含菌数为1 ×10 6 CFU/mL 的菌悬液。LB 固体培养基灭菌后倾倒在直径90 mm 的培养皿中，吸取配制好的菌悬液100 μL ，加入LB 固体培养基中，用涂布棒将菌液涂布均匀。取高压灭菌后直径6 mm 的空白药敏纸片，分别加入20μL 各热解温度木醋液原液，空白对照组加入20 μL 无菌水，阳性药组加入20μL 红核妇洁洗液。将加好木醋液的药敏纸片贴于已涂菌的培养基表面，各热解温度木醋液均设3 个重复。将细菌平板倒置于37 ℃生化培养箱，培养24 h ，十字交叉法测量其抑菌圈 直径，参照药物敏感试验判定标准（表5），判断不同解热温度山茱萸果核木醋液抑菌活性强弱。结果见表6。

由表5 、6 可知，406 ～600 ℃的木醋液对供试菌种均有一定的抑制效果，敏感度在中敏到高敏之间，3 种供试菌对于有效木醋液的敏感顺序为：痢疾杆菌＞大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌；不同解热温度山茱萸果核木醋液对于供试菌种的抑制效果强弱顺序为W 506～556＞W 456～506＞W 556～600＞W 406～456。对于大肠杆菌和痢疾杆菌，W 506～556的抑菌效果与其他解热温度木醋液和红核妇洁洗液组均具有极显著性差异，对于金黄色葡萄球菌，W 506～556的抑菌效果与W 556～600和W 406～456组具有极显著性差异。此外，W 456～506与W 506～556的产量都很大，并且两者对于供试菌的抑制效果相近，提示在以后的工业生产中可将2 段合并利用。山茱萸果核木醋液整体上对革兰阴性菌的抑制效果优于革兰阳性菌，对痢疾杆菌的抑制作用最强。

2.5.2最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration ，MIC ）的测定参照美国临床标准协会（CLSI ）M07-A9 微量肉汤稀释法[16]，选取抑菌效果最明显的W 506～556进行MIC 的测定。在超净工作台中吸取100 μL MH 依次加入灭菌96 孔板的第1 、2 、3 行木醋液组的2 ～12 列中，第4 、5 、6 行阳性药组的2 ～12 列中，第7 、8 行空白对照组的1 ～12 列中；吸取木醋液100 μL 加入第1 、2 、3 行的第1 列孔中，混合均匀后吸取100 μL 加入到第1 、2 、3 行的第2 列孔中，混合均匀后再吸取100 μL 到各行第3 孔，依次进行梯度稀释，最后吸取100 μL 制备好的菌悬液加入96 孔板中，混合均匀，使木醋液浓度为25%～0.048 83%。阳性对照组、空白对照组同上。置于37 ℃生化培养箱培养24 h ，用肉眼观察可100% 抑制细菌生长的浓度为MIC 。实验重复3 次，以红核妇洁洗液作为阳性对照，无菌水作为空白对照，结果见表7 。W 506 ～556 对大肠杆菌和痢疾杆菌的MIC 为0.781 25% ，对金黄色葡萄球菌的MIC 为1.562 50% 。

2.5.3 相关性分析选 取不同热解温度木醋液相对含量较高的10种成分（正戊酸、丁酸、异戊酸、乙酸、丙酸、异丁酸、糠醛、愈创木酚、2,6- 二甲氧基苯酚、甲基环戊烯醇酮），采用SPSS 22.0 软件，以抑菌圈直径为自变量（Y ），成分含量为因变量（X ）进行相关分析，建立10 个成分质量浓度与其药效学的Pearson相关系数，见表8。

表8显示，山茱萸果核木醋液抑菌效果与糠醛质量浓度呈负相关，与其他9种成分呈正相关。3种供试菌的抑菌圈直径与所测10种成分质量浓度的相关性均为强相关，6种酸类成分中异戊酸相关性最高，酚类中愈创木酚相关性最高，这提示山茱萸果核木醋液的抑菌活性与其酸类和酚类物质协同作用密切相关。

3 讨论

随着畜禽养殖行业“禁抗、减抗”政策的出台，市场对于天然抑菌剂的需求显著增加。木醋液因其抑菌作用明确，已广泛用于天然抑菌剂的开发。本课题组前期基于文献报道及课题组研究实践，提出了基于热解炭化技术的中药资源固废物生物炭及木醋液资源化利用策略[13]。中药山茱萸作为我国大宗药材之一，其采收加工过程中产生大量的果核资源如何资源化利用已成为山茱萸产业亟待解决的问题。为充分利用山茱萸果核资源，减少药材生产过程中的浪费和排放，本研究采用热解炭化技术制备了山茱萸果核木醋液，考察了不同热解温度山茱萸果核木醋液的组成成分及 质量浓度，并对其针对大肠杆菌、痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性进行了评价，结果显示山茱萸果核木醋液具有良好的抑菌活性，提示其可作为开发利用山茱萸果核资源的一种途径。

近年来，国内外学者对木醋液发挥抑菌活性的化学组成进行了研究，但研究结果尚不一致。有研究表明，木醋液有机酸的含量与其抑菌活性直接相关[5-6]；也有研究表明木醋液中酚类物质对其抑菌活性起决定性作用[17-18]。为明确山茱萸木醋液中发挥抑菌活性的主要物质基础，本研究选取抑菌效果较好的W 506～556对其主要活性组分进行了分析，其醋酸乙酯萃取液中共鉴定出62 种化合物，面积归一化法计算其相对含量较高的为有机酸类，占66.98% ，其次为酚类、醛类和酮类等成分。有研究在枣核木醋液中鉴定出35 种化合物[9]，在杜仲枝木醋液中鉴定出33 种化合物[12]，对比分析发现各类木醋液中所含化合物类型基本相似，主要为有机酸类、酚类、醛类、酮类、醇类和酯类等，仅为具体占比有所差异，其可能与热解原材料、热解工艺及精制方法等不同有关。此外，采用外标法对山茱萸果核木醋液的10 种主要成分进行了含量测定，10 种成分中除糠醛外均在W 506～556中 质量浓度达到最高， W 506～556中有机酸含量可达20% 以上。通过将不同解热温度木醋液样品10 种主要组 质量浓度与其抑菌活性进行相关性分析，结果发现抑菌效果与有机酸 质量浓度整体呈正相关，而与糠醛 质量浓度呈负相关。也有研究报道，糠醛可用于农药的生产，具有 杀虫杀螨的作用，但糠醛有剧毒，也被世界卫生组织列入3类致癌物清单中。上述结果提示，相较于其他热解温度所得木醋液，W 506～556在具有良好抑菌活性的同时安全性也更高。

综上所述，山茱萸果核木醋液作为天然抑菌剂具有较好的应用潜力。本研究结果为山茱萸果核木醋液作为抑菌剂开发提供了理论基础，也为山茱萸果核的资源化利用提供了新的途径。此外，在制备山茱萸果核木醋液的同时也形成了生物炭，其在土壤改良、环境污染治理等方面有着广阔的应用前景，倘若将其用于山茱萸种植产业，不仅会提升山茱萸果核资源利用效率，也有助于构建山茱萸资源循环经济产业链，促进山茱萸产业绿色发展。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：张浩宽，郭 盛，尚尔鑫，张 森，严 辉，钱大玮，高 松，李俊科，段金廒．山茱萸药材加工过程废弃物制备木醋液的化学成分分析及抑菌活性评价 [J]. 中草药, 2022, 53(4): 1372-1381 .返回搜狐，查看更多