FSHW

　　Introduction

　　以高血糖为特征的糖尿病是一种异质性和复杂性疾病。全球T2DM（2型糖尿病）的高患病率将导致更多糖尿病并发症，如肾脏疾病、心血管疾病、视网膜病变和神经病变等。因此，迫切需要采取行动策略以预防和改善糖尿病。

　　人体内的肝脏在碳水化合物、氨基酸、脂肪和蛋白质的代谢中起着主导作用。肝脏通过糖原生成和糖异生途径维持葡萄糖的动态平衡。葡萄糖的摄取受胰岛素调节，胰岛素与胰岛素受体的结合会激活一个复杂的信号通路。胰岛素受体底物1（IRS-1）和胰岛素受体底物2（IRS-2）是胰岛素受体的主要底物蛋白，与磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的活化有关。该酶与脱氢酶激酶同工酶1（PDK1）结合，通过磷酸化激活Akt，进而使细胞质糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）失活。同时，胰岛素还能刺激葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）的激活。因此，IRS-1/2/PI3K/Akt信号通路可以通过GLUT4和GLUT2确定。此外，高糖刺激型糖尿病的特点是活性氧（ROS）和晚期糖基化终末产物（AGEs）的升高，这与糖尿病并发症相关。存在于植物和植物性食品中的膳食多酚具有抗氧化和抗炎活性等多种生物学特性，是预防和缓解糖尿病的可能药物。然而，其抗糖尿病的作用机制仍需进一步研究。

　　本文采用高糖和地塞米松（DXMS）模拟产生胰岛素抵抗（IR）的HepG2细胞，以评估芹菜素、木犀草素和黄芩素的抗糖尿病生物活性（图1）。同时，利用该细胞模型探究ROS、AGEs及相关的IRS1/2/PI3K/Akt/Glut4和NF-κB P65信号通路。此外，还探讨了黄酮类化合物的代谢过程及其与药理的潜在关系。通过本项研究可以为膳食常见具有抗糖尿病潜力的天然黄酮类化合物的评价提供新见解，这对于缓解糖尿病具有重要意义。

　　图1  （A）芹菜素、（B）木犀草素和（C）黄芩素的化学结构

　　Results

　　黄酮类化合物对IR-HepG2细胞活力的影响

　　通过测定细胞活力排除黄酮类化合物（芹菜素、木犀草素和黄芩素）对IR-HepG2细胞和正常HepG-2细胞在24 h内的细胞毒性作用。筛选证实芹菜素、木犀草素的安全浓度为6.25和12.5 μmol/L，黄芩素的安全浓度为12.5和25.0 μmol/L（图2A和B）用于后续实验。

　　图2  黄酮类化合物对正常和IR-HepG2细胞活力的影响

　　黄酮类化合物对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗和糖原合成能力的影响

　　采用相应的试剂盒研究黄酮类化合物对细胞葡萄糖消耗能力和细胞内糖原合成能力的影响，以评价其抗糖尿病潜力。经高糖和DXMS刺激后，IR-HepG2细胞在培养基中消耗的葡萄糖浓度从6 mmol/L降至3 mmol/L，与对照组相比表现出近50%的抑制作用。不同浓度的黄酮类化合物可以在不同程度上恢复高糖和DXMS诱导的IR-HepG2细胞的葡萄糖消耗能力（图3A和B）。如图3C所示，高糖和DXMS刺激可使IR-HepG2细胞内合成糖原降低一半，而黄酮类化合物可显著增加细胞内糖原含量。

　　图3  黄酮类化合物对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗和糖原合成能力的影响

　　通过蛋白质印迹分析GLUT4的表达水平，进一步探究黄酮类化合物对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗和糖原合成能力的影响机制。结果表明，这些黄酮类化合物可通过上调IR-HepG2细胞中GLUT4的表达，改善IR-HepG2细胞受损的葡萄糖消耗和糖原合成能力。此外，如图3E所示，高糖和DXMS组的p-GSK-3β和GSK-3β表达水平的比值低于对照组，而黄酮类化合物显著增加了糖尿病HepG-2细胞的p-GSK-3β和GSK-3β表达比例，进而帮助IR-HepG2细胞恢复糖生成能力。

　　黄酮类化合物对IR-HepG2细胞中IRS-1/IRS-2/PI3K/Akt信号通路蛋白表达的影响

　　以GADPH为内标，通过蛋白质印迹分析IRS-1、IRS-2、PI3K、Akt及其磷酸化形式p-Akt的表达水平，进一步探究黄酮类化合物缓解IR-HepG2细胞糖尿病症状的机制。如图4A所示，6.25 μmol/L的芹菜素和25 μmol/L的黄芩素处理组IRS-1表达水平显著增加，25 μmol/L的黄芩素可以上调IRS-2的表达水平。此外，如图4B所示，PI3K的表达水平以及p-Akt/Akt表达水平的比值均受到轻微抑制，但芹菜素处理组增加约2倍（PI3K）和2.5倍（p-Akt/Akt）。因此，这些黄酮类化合物可能部分激活IRS-1/IRS-2/PI3K/Akt信号通路，从而展现出抗糖尿病活性。

　　图4  黄酮类化合物对（A）IRS-1和IRS-2，（B）PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达的影响

　　黄酮类化合物对IR-HepG2细胞中AGEs和ROS含量的调节

　　为探究黄酮类化合物（均采用较高浓度：12.5 μmol/L芹菜素和木犀草素，25 μmol/L黄芩素）对AGE-氧化应激轴的影响，测定了细胞内AGEs和ROS的含量。与对照相比，高糖和DXMS使AGEs浓度增加约3倍，而黄酮类化合物（尤其是芹菜素和黄芩素）处理可以降低AGEs浓度（图5A）。ROS水平（换算为DCFH-DA平均强度）在糖尿病模型组也显著升高，而所有黄酮类化合物组均显著降低（图5B）。流式细胞术的结果与显微镜下的荧光强度相似（图5C）。此外，p-P65（磷酸化P65）和P65表达的比例受糖尿病诱导显著上调，而所有黄酮类化合物（尤其是木犀草素和黄芩素）均能抑制该基因的表达（图5D）。以上结果表明，黄酮类化合物通过抑制AGEs和ROS的表达发挥抗糖尿病作用，还可以通过部分抑制NF-κB信号传导而表现出抗炎活性，以缓解糖尿病的炎症。

　　图5  黄酮类化合物对糖尿病HepG-2细胞内AGEs和ROS的影响

　　IR-HepG2细胞中黄酮类化合物的代谢情况

　　进一步对膳食中黄酮类化合物的细胞内代谢状况进行评价以揭示其抗糖尿病作用的体外机制。以IR-HepG2细胞为研究对象，在5、30 min和16 h用不同浓度的黄酮类化合物处理细胞，观察细胞内代谢变化。结果表明，芹菜素、木犀草素和黄芩素进入细胞后，从5 min到30 min其强度显著增加，而在16 h的时间点上几乎没有检测到这些化合物的结构（图6A-C）。上述黄酮类化合物的代谢产物通过进入IR-HepG2细胞可以调节细胞内不同的级联反应，从而达到药理活性。

　　图6  黄酮类化合物及其代谢产物在IR-HepG-2细胞内的代谢情况

　　Discussion

　　膳食类黄酮抗糖尿病作用机制可能是通过上调葡萄糖消耗和糖原合成，激活IRS-1和IRS-2的蛋白表达，部分上调PI3K/Akt/GSK/GLUT4信号通路，显著抑制ROS和AGEs以及抑制NF-κB P65的表达。如图7所示，本文研究表明，这三种黄酮类化合物可以通过促进葡萄糖消耗和糖原合成，抑制ROS和AGEs的产生，从而改善高糖和DXMS诱导的糖尿病。其抗糖尿病作用机制涉及IRS-1/IRS-2/PI3K/Akt/GSK-3β和GLUT4信号通路的激活，以及NF-κB P65表达的抑制。因此，这些植物性膳食黄酮类化合物在预防糖尿病方面具有广阔的应用潜力。

　　图7  本文主要研究结论

　　Lingchao Miao

　　a

　　, Haolin Zhang

　　a

　　, Meng Sam Cheong

　　a

　　, Ruting Zhong

　　a

　　, Paula Garcia-Oliveira

　　b

　　, Miguel A. Prieto

　　b

　　, Ka-Wing Cheng

　　c

　　, Mingfu Wang

　　c,d

　　, Hui Cao

　　b,e

　　, Shaoping Nie

　　f

　　, Jesus Simal-Gandara

　　b

　　, Wai San Cheang

　　a,*

　　, Jianbo Xiao

　　b,g,

　　*

a

　　b

　　Department of Analytical Chemistry and Food Science, Faculty of Food Science and Technology, University of Vigo-Ourense Campus, Ourense E-32004, Spain

　　c

　　Institute for Advanced Study, Shenzhen University, Shenzhen 508060, China

　　d

　　School of Biological Sciences, The University of Hong Kong, Hong Kong 999077, China

　　e

　　College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety, Guangdong Province Engineering Laboratory for Marine Biological Products, Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center of Seafood, Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Product of Guangdong Higher Education Institution, Zhanjiang 524088, China

f

　　g

　　International Research Center for Food Nutrition and Safety, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China

　　*Corresponding authors.

　　Dietaryflavonoidsare abundant in natural plants and possess multiple pharmacological and nutritional activities. In this study,apigenin,luteolin, andbaicaleinwere chosen to evaluate their anti-diabetic effect in high-glucose anddexamethasoneinduced insulin-resistant (IR) HepG2 cells. All flavonoids improves theglucose consumptionandglycogen synthesisabilities in IR-HepG2 cells via activating glucose transporter protein 4 (GLUT4) and phosphor-glycogen synthase kinase (GSK-3β). These flavonoids significantly inhibited the production ofreactive oxygen species(ROS) and advancedglycationend-products (AGEs), which were closely related to the suppression of the phosphorylation form of NF-κB and P65. The expression levels ofinsulin receptorsubstrate-1 (IRS-1), insulin receptor substrate-2 (IRS-2) and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) pathway in IR-HepG2 cells were all partially activated by the flavonoids, with variable effects. Furthermore, the intracellular metabolic conditions of the flavonoids were also evaluated.

　　Reference:

　　MIAO L C, ZHANG H L, CHEONG M S, et al. Anti-diabetic potential of apigenin, luteolin, and baicalein via partially activating PI3K/Akt/Glut-4 signaling pathways in insulin-resistant HepG2 cells[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(6): 1991-2000. DOI:10.1016/j.fshw.2023.03.021.