《食品科学》：中南林业科技大学王青云副教授等：枯草芽孢杆菌PW2产挥发性物质对赭曲霉的抑制作用

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赭曲霉（Aspergillus ochraceus）广泛生长在粮食、水果、咖啡、油料、茶叶等食品原料及其加工产品。其产生的次级代谢产物赭曲霉毒素A（OTA）具有致癌、致畸、遗传毒性和免疫抑制作用。芽孢杆菌（Bacillus）对真菌的抑制作用多是源于其产生的抗菌蛋白、脂肽类及挥发性物质（VC），其中抗菌蛋白和脂肽类的研究已比较成熟，而具有抗霉活性的VC开始成为近年来研究的热点。

中南林业科技大学余 璐，魏 琛，王青云等在前期研究中从稻谷中分离出1 株产抗霉VC的枯草芽孢杆菌PW2，以其所产VC为研究对象，鉴定其组分，测定所鉴定出单个化合物标准品对赭曲霉生长的抑制效果，从中筛选出关键抗霉挥发性物质（KAVC），研究KAVC对赭曲霉生长及产毒的抑制效果，并探讨其抗霉作用机理，旨在为探寻新型的食品用防霉熏蒸剂提供理论依据。

1 结果与分析

1.1 PW2所产VC的成分组成

如表1所示，PW2所产VC共鉴定出41 种组分，主要有酯、醛、烷烃、醇、酮、酸、烯烃等化合物。所鉴定出挥发性成分中，2-壬酮已被报道可有效抑制水果中灰葡萄孢菌等腐败真菌的生长，且已被作为水果的抗真菌剂使用；十二醇能有效防治黄瓜霜霉病；异辛醇能降低柑橘采后被指状青霉感染的机率；异丁酸可有效抑制尖孢镰刀菌菌丝生长。虽然这些成分已被证明对植物病原菌具有抗霉活性，但其对赭曲霉的抑制作用鲜见报道。选取上述4 种成分和在VC中含量相对较高的2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯，购买这5 种化合物的标准品进一步研究其对赭曲霉的抑制作用。

1.2 KAVC的确定

通过平板对扣法测定5 种化合物标准品对赭曲霉生长的抑制作用，结果如图1所示。30 ℃培养7  d后，对照组赭曲霉菌落生长正常，十二醇对赭曲霉菌落生长的抑制不显著（P＞0.05），其他4 种化合物对赭曲霉生长都有显著抑制作用，其中异辛醇对赭曲霉的抑菌活性最强。因此，将异辛醇确定为KAVC并进行下一步的研究。

1.3 异辛醇对赭曲霉的MIC及MBC

倍半稀释法测定异辛醇在接触条件下对赭曲霉的MIC

如图2所示，能维持刃天青不变色的异辛醇最低剂量为1 562.5 μL/L，在此剂量下对应的孔中未见赭曲霉菌丝生长。当剂量低于1 562.5 μL/L时，对应孔中指示剂变为浅粉色或无色，肉眼可观察到孔内有菌丝体长出。因此，接触条件下异辛醇对赭曲霉生长的MIC为1 562.5 μL/L。

平板对扣法测定异辛醇在挥发条件下测得异辛醇对赭曲霉的MIC和MBC

如图3A所示，对照皿中赭曲霉正常生长，剂量为56 μL/L的异辛醇处理组赭曲霉有少量生长，而其他处理组中赭曲霉均未见生长，将未见生长的赭曲霉孢子转接至新鲜PDA平板上培养。转接后的生长情况如图3B所示，观察到112、169、225 μL/L的处理组均恢复生长，而281 μL/L和337 μL/L的处理组均未恢复生长，可知异辛醇对赭曲霉的 最低抑菌浓度 MIC 和 最低杀菌浓度 MBC 分别为 112 μL/L 和 281 μL/L 。

1.4 异辛醇对赭曲霉产毒的影响

由图4可知，与对照组相比，各处理组的OTA产量均显著降低（P＜0.05）。当异辛醇剂量为MIC时，赭曲霉产生OTA量最低，与对照组相比其抑制率为23.67%。异辛醇可以有效降低OTA的产生，其抑制率随异辛醇剂量增加而增高。

1.5 异辛醇对赭曲霉生长的作用机制

异辛醇对赭曲霉孢子形态的影响

由图5可知，未经异辛醇处理的赭曲霉孢子形态完整、表面光滑，而经异辛醇处理后部分孢子出现凹陷，随着异辛醇剂量的增加出现凹陷孢子增多，凹陷程度也在增加，且当异辛醇为2 MIC时孢子还出现干瘪，褶皱的现象。推测可能是异辛醇处理导致孢子内容物流失，从而在外形上出现干瘪和凹陷。

异辛醇对细胞膜完整性的影响

碘化丙啶PI是一种核酸染料，不能透过正常完整的细胞膜，当细胞膜破损时，PI能透过破损的细胞膜继而与DNA结合产生红色荧光，从而用于检测细胞膜的完整性。如图6所示，明场下观察，对照组的孢子体积明显膨大，而异辛醇处理组的孢子未出现体积膨大；暗场下观察，对照组孢子没有产生红色荧光，而异辛醇处理组产生红色荧光，还观察到异辛醇剂量为4 MIC时大量孢子被异辛醇包裹着且产生红色荧光。结果说明异辛醇处理后的赭曲霉孢子细胞膜完整性丧失。

异辛醇对赭曲霉麦角甾醇含量的影响

麦角甾醇是真菌中一种独特的甾醇，是细胞膜的主要成分，主要保持细胞完整性和膜流动性。如图7所示，与对照组相比较，在1/4 MIC、1/2 MIC和MIC的异辛醇作用下各处理组赭曲霉的麦角甾醇含量分别降低了42.68%、65.08%和65.40%。说明异辛醇导致赭曲霉细胞膜中麦角甾醇含量降低，细胞膜的结构和功能受到破坏。这与2.5.2节中PI染色的观察结果一致。

异辛醇对赭曲霉胞内物质泄漏的影响

如图8所示，随处理时间的延长，培养液中的核酸和蛋白含量均增加，且处理组与对照组之间差异也随着时间的延长而逐渐显著（P＜0.05）。说明异辛醇对赭曲霉核酸和蛋白泄漏情况受处理时间的影响，且其作用效果存在剂量依赖性。异辛醇可能通过改变细胞膜的通透性，使赭曲霉的核酸和蛋白泄漏，从而导致赭曲霉的生长被抑制。

3 讨论

本研究结果表明枯草芽孢杆菌PW2所产具有抗霉活性的VC中含有酯、醛、烷烃、醇、酮、酸、烯烃类等41 种成分，从这些成分中初步筛选出5 种单体化合物，购买其标准品并测定它们对赭曲霉的抗霉活性，发现异辛醇对赭曲霉的抗霉活性最强。研究说明异辛醇具有抗真菌活性和值得信赖的安全性，其挥发性质易于扩散到食物中，有望成为食物防霉的新资源，但其抗霉的作用机制还有待研究。

本研究测得异辛醇对赭曲霉有显著抗菌活性，且呈剂量依赖关系，不管是在挥发条件下还是接触条件下，赭曲霉的生长随着异辛醇剂量的增高而逐渐被抑制。异辛醇在接触条件下对赭曲霉的MIC值远高于挥发条件。与直接加入原料中相比，挥发条件下的抑制效果更好，异辛醇更适合以熏蒸剂的形式使用。使用熏蒸处理是防止食品腐败的理想方法，快速有效，而且残留少。

本研究异辛醇处理后的赭曲霉孢子外形出现干瘪和凹陷，赭曲霉细胞膜完整性被破坏，麦角甾醇含量降低以及胞内物质泄露均可推测异辛醇对赭曲霉的作用机制可能是与破坏其细胞膜有关。

由于VC具有高挥发性在应用中会受到限制，目前对VC用于防霉的应用研究中基本是将VC包埋在载体上，有将精油通过壳聚糖纳米乳剂的包埋，有将反式肉桂醛、甲基丁香酚和雌二醇等VC复合包埋在壳聚糖纳米生物聚合物中，也有将茴香精油包埋在壳聚糖纳米聚合物中，提高VC的稳定性和有效性以应用于食品防腐。

4 结论

枯草芽孢杆菌PW2所产具有抗霉活性的VC中异辛醇对赭曲霉生长抑制作用最强，异辛醇作为熏蒸剂使用时具有更低的MBC，其抑杀赭曲霉的作用机理与破坏细胞膜完整性有关。目前还鲜见对于异辛醇应用于防霉的研究，而异辛醇作为VC，具有高挥发性和不稳定性，后续研究可以将其采用纳米包埋的方式，提高异辛醇的稳定性和有效性，以此开发安全、高效的新型防霉熏蒸剂。异辛醇用于食品熏蒸防霉其残留量、安全性及系统的抗霉机理等问题有待进一步研究探讨。

本文《枯草芽孢杆菌PW2产挥发性物质对赭曲霉的抑制作用》来源于《食品科学》2023年44卷第14期125-133页，作者：余璐,魏琛,张凯歌,等。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220802-023。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：美娟；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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