蛋白质印迹（Western blot）实验方案

所有泳道：beta Actin 抗体 - 内参对照 (ab8227)，稀释度为 1/5000

泳道 1：HeLa 全细胞提取物

泳道 2：酵母细胞提取物

泳道 3：小鼠脑组织裂解液

实验方案由 Abcam 根据 Abcam 实验室使用 Abcam 试剂和产品开展的实验“按原样”提供；在其他条件下使用实验方案得出的结果可能会有所不同。

Western blot 的目的在于按照分子量大小在凝胶上分离蛋白。然后将蛋白转移到膜上，从而使用抗体对蛋白进行检测。在含有还原剂（如 β-巯基乙醇）的样本缓冲液中，95 ℃ 下加热样本 5 到 10 分钟。这样可以让线性化蛋白带上与其大小成正比的负电荷。

将凝胶放入电泳槽中并加入缓冲液，确保孔的顶部被缓冲液覆盖。所用凝胶的丙烯酰胺百分比取决于靶蛋白的分子量。将分子量标志物上样至第一泳道，然后将样本上样至相邻的孔中。所有样本均含有等量蛋白。所有样本完成上样后，添加电泳缓冲液，给电泳槽盖上盖子。打开电源，按照制造商的推荐设置凝胶槽中凝胶的电压。这时应该能够看到凝胶槽中有上升的气泡。跑胶，直到染料前沿充分移动至凝胶。

下一阶段是将蛋白从凝胶转移到膜。膜通常由硝化纤维或 PVDF 制成。从凝胶槽中取出凝胶，并小心地将它从塑料盒中释放。切断孔和凝胶脚，并将凝胶放入转膜缓冲液中。将膜和凝胶夹在滤纸和海绵之间，制备转膜层。膜应靠近正极，凝胶应靠近负极。使用小滚筒去除凝胶和膜之间的气泡。夹住关闭的转膜箱，并将它浸入含有转膜缓冲液的转膜槽中。向外室加水，以保持系统冷却，并盖上盖子。打开电源，开始转移蛋白。时间和电压需要优化，请查看制造商的说明。

现在蛋白已经从凝胶转移到硝酸纤维素膜上了，可以用抗体检测目标蛋白了。膜可以从盒中取出，现在应该可以看到分子量标志物了。如有需要，可以用丽春红 S 溶液对膜进行染色，从而确认蛋白质的转移。为了防止抗体发生非特异性结合，需要封闭膜。将封闭缓冲液倒在膜上，并置于摇床上轻轻摇动。通常情况下，需要使用 5% 牛奶或牛血清白蛋白（BSA）溶液在室温下孵育两小时或 4℃ 下孵育过夜。应优化封闭缓冲液的时间和类型，请查看您打算使用的一抗的数据表，了解详细信息。

膜封闭后，去除封闭缓冲液，在同一溶液中加入稀释的一抗。与之前一样，置于摇床上孵育。通常会在室温下孵育一抗 1 小时或 4℃ 下孵育过夜。抗体浓度和孵育时间需要优化。如需任何指导，请查阅抗体数据表。倒出一抗，用洗涤缓冲液冲洗膜两次。随后在摇床洗涤膜 1 次，时长 15 分钟，再洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。洗涤缓冲液通常是含 0.1% 吐温 20 的 Tris 缓冲盐溶液（TBS）或磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）。

倒掉洗涤缓冲液，在偶联二抗中孵育膜，二抗需先在封闭缓冲液中稀释。通常要在室温下孵育一小时，但抗体浓度和孵育时间需要优化。倒掉二抗，并按照上述步骤清洗膜。

有几种不同的检测系统。如果二抗与酶偶联，则成像前，应在合适的底物中孵育膜。如果二抗是荧光偶联二抗，可以直接进入成像步骤。成像时使用 X 射线胶片或数字成像系统。将膜放入成像托盘中。将成像托盘放入成像系统。为了清楚地检测与目标蛋白相关的条带，可能需要优化曝光时间。