一种早期快速诊断肺炎支原体的方法与流程

本发明属于生物检测领域，涉及肺炎支原体一步法可视化环介导等温扩增检测方法。

背景技术：

肺炎支原体(mycoplasmapeumoniae，mp)是引起原发性非典型肺炎等呼吸道感染性疾病的常见病原体，通过呼吸道传播，并以婴幼儿多见。支原体肺炎的临床表现不典型，与其他常见呼吸道疾病所致的感染非常相似，仅凭临床症状，无病原学诊断，往往难以做出准确的早期诊断。目前血清学检测和核酸检测是临床常用的肺炎支原体检测方法，血清学诊断易受患儿年龄、病程和抗生素治疗的影响，产生漏诊，错诊。

lamp是一种体外恒温扩增特异dna片段的新技术，它可在短时间内使极微量的核酸片段扩增至数百万个拷贝，具有特异性强、灵敏度高和简便快速的优点，它已广泛应用于人类流行病的检测。但该技术与一步法核酸提取相结合并应用于人类肺炎支原体的检测还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的针对现有技术的不足之处，提供一种肺炎支原体的一步法可视化环介导等温扩增检测方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种用于肺炎支原体的一步法可视化环介导等温扩增检测的引物组，正向外引物f3、反向外引物b3、正向内引物fip和反向内引物bip的序列如下表：

fip(f1c、f2)和bip(b1c、b2)分别由2部分组成，两者之间以tttt链接。

所述的引物组在制备肺炎支原体的一步法可视化环介导等温扩增检测试剂盒中的应用。

一种用于肺炎支原体的一步法可视化环介导等温扩增检测的试剂盒，包含本发明所述的引物组。

所述的试剂盒包含以下lamp反应液：

肺炎支原体的一步法可视化环介导等温扩增检测方法，使用本发明所述的引物组进行lamp反应，由于体系中添加hnb实现扩增结果可视化；反应管呈天蓝色为阳性，表示被检样品含有肺炎支原体；紫色为阴性，表示被检样品不含肺炎支原体。

附图说明

图1：可视化lamp反应体系优化电泳图。

a.mg2+浓度优化。m：dl2000dnamarker；1～5.mg2+终浓度分别为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mmol/l。

b.dntp浓度优化。m：dl2000dnamarker；1～6.dntps浓度分别为0.2mmol/l、0.4mmol/l、0.6mmol/l、0.8mmol/l、1.0mmol/l、1.2mmol/l.

c.bstdna聚合酶浓度优化。m：dl2000dnamarker；1～5：bstdnapolymer分别为3.2，4.8，6.4，8.0，9.6u。

d.内外引物浓度比优化。m：dl2000dnamarker；1～5内外引物浓度比分别为0.2μmol/l∶0.4μmol/l、0.2μmol/l∶0.8μmol/l、0.2μmol/l∶1.6μmol/l、0.2μmol/l∶2.4μmol/l、0.2μmol/l∶3.2μmol/l。

图2：可视化肺炎支原体lamp体系指示剂浓度结果

1～6：hnb浓度分别为60μmol/l、120μmol/l、180μmol/l、240μmol/l、300μmol/l和360μmol/l.

图3：可视化lamp灵敏性试验

一步法显色肺炎支原体灵敏度结果.1～4：2×104，2×103，2×102，2×101拷贝/ml肺炎支原体p1质粒5：ddh2o

b：电泳验证结果.m：2000dnamarker；1～4：2×104，2×103，2×102，2×101拷贝/ml肺炎支原体p1质粒5：ddh2o.

具体实施方式

实施例1肺炎支原体lamp引物设计及反应体系优化

登陆ncbi，查找所有mpp1基因序列，用bioedit软件进行同源性比较，针对同源性较好的序列采用primerexplorerv4软件设计lamp引物，包括2条外引物f3、b3和2条内引物fip(f1c、f2)、bip(b1c、b2)，内引物各由两部分组成，两者之间以tttt链接。引物及靶序列的结合区域如下：

原始反应体系为：

(1)mg2+浓度优化，分别添加mg2+终浓度2.0mmol/l、3.0mmol/l、4.0mmol/l、5.0mmol/l、6.0mmol/l；

(2)dntp浓度优化，分别添加dntps终浓度0.2mmol/l、0.4mmol/l、0.8mmol/l、1.6mmol/l、3.2mmol/l、6.4mmol/l；

(3)bstdna聚合酶浓度优化，添加bstdna聚合酶终浓度分别为3.2u、4.8u、6.4u、8.0u、9.6u。

(4)内外引物浓度比优化，外引物f3/b3与内引物fip/bip浓度比分别为0.2μmol/l∶0.4μmol/l、0.2μmol/l∶0.8μmol/l、0.2μmol/l∶1.6μmol/l、0.2μmol/l∶2.4μmol/l、0.2μmol/l∶3.2μmol/l。

反应结束后均以1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，以电泳条带最明显的泳道参数为最佳反应条件。每次实验确定一个项目，下一个优化项目在已优化好的项目基础上进行。

(5)hnb浓度优化，其它组分采用最优浓度，3mmol/lhnb分别添加0.5μl、1.0μl、1.5μl、2.0μl、2.5μl、3.0μl，ddh2o补足至25.0μl，使最终hnb浓度为60μmol/l、120μmol/l、180μmol/l、240μmol/l、300μmol/l、和360μmol/llamp63℃反应60min直接肉眼观察各管颜色变化。

从实验电泳图1-a看出当mg2+浓度为3.0mmol/l～5.0mmol/l时扩增效果变化不大，因此确定4.0mmol/lmg2+浓度为最佳浓度；由图1-b和1-c可知dntps浓度600μmol/l、bstdna聚合酶为8.0u时扩增效果最佳；由图1-d可以看出当内外引物浓度比为0.2μmol/l∶0.8μmol/l、0.2μmol/l∶1.6μmol/l时效果最佳，考虑成本因素，选择0.2μmol/l∶0.8μmol/l作为最佳内外引物浓度比；由图2可知当hnb浓度增加至180μmol/l时，颜色变化最明显，再增加无明显变化，因此最终确定hnb浓度为180μmol/l。

优化后反应体系如下：

将配制好的lamp反应液于63℃反应60min；观察各反应管颜色变化，反应管呈天蓝色为阳性，表示被检样品含有肺炎支原体；紫色为阴性，表示被检样品不含肺炎支原体。

实施例2肺炎支原体一步法可视化lamp灵敏度实验

将稀释成2×104拷贝/ml～2×101拷贝/mlp1质粒分别加入到显色lamp反应液中，于63℃恒温条件下反应60min，结果如图3-a所示，模板浓度为2×101拷贝/mlp1质粒的反应管始终为紫色(未扩增)，而模板浓度为2×102拷贝/mlp1质粒反应管变成天蓝色，可判定本方法的最低检出限为2×102拷贝/ml。凝胶电泳检测扩增产物，结果如图3-b，天蓝色的反应管电泳出现梯状条带，而反应管始终为紫色的，电泳结果也为阴性，证实了本实验所建立的显色法lamp的准确性。

实施例3肺炎支原体一步法可视化lamp在临床诊断中的应用

随机选取浙江省金华市人民医院2016年4月-2017年12月儿科门诊患儿咽拭子标本和血清标本100例，年龄为6个月～12岁；病程为≤3周；无哮喘、先天性或慢性肺部疾病，其中病例组80例，支原体肺炎确诊者55例；对照组20例，取自临床排除儿童支原体肺炎的其他慢、急性呼吸道感染者。将咽拭子加入到含1mlte的无菌管中，充分混匀后加0.5ml2×rose提取缓冲液(提取缓冲液为1％sds，10mmol/ltris，0.3mol/ledta，1％pvpp，ph8.0)，混匀后置于90℃水浴中，不时颠倒混匀，孵育20min后，置于冰浴中5min制成dna粗提取液。取2μl加入到显色lamp反应液中，于63℃恒温条件下反应60min，天蓝色的为阳性，紫色的为阴性。结果显示仅有一例检测结果临床诊断阴性，而本方法检测为阳性，说明本方法与临床诊断具有良好的一致性。

有益效果：

本发明首次将dna快速粗提取方法与lamp反应相结合并应用于肺炎支原体的检测。节省了常规提取dna所花费的时间，简化操作过程，加快了肺炎支原体检测，实现对肺炎支原体一步法可视化检。