荧光定量PCR的原理、流程及结果分析

3.qPCR的流程

4.qPCR的结果分析

在qPCR进程中，随着产物的积累，荧光信号的强度等比加强。每经过一次循环，收集一次荧光信号，即可得到一个荧光扩增曲线，根据荧光强度的变化即可监测产物量的变化。荧光扩增曲线可分为三个阶段，即荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，因此可以在该阶段进行定量分析。为了便于对所检测样本进行比较，在指数期需要设定一个荧光信号的阈值。检测到的荧光信号超过阈值则被认为是真正的信号。荧光信号由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数称为Ct值。模板的Ct值与其起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，则Ct值越小利用已知起始拷贝数的标准品及其相应的Ct值可绘制出标准曲线，测得未知样品的Ct值后，根据标准曲线便可准确计算出该样品的起始拷贝数。

荧光定量 PCR 的扩增曲线（左）和模板量与 Ct 值的关系（右）

目前，qPCR技术已在生物医药食品等行业有广泛应用，比如疾病的早期诊断、肿瘤的诊断与研究、食品病原微生物的检测、转基因食品检测、基因扩增等。

（1）致病菌与食品安全环境卫生等方面息息相关，因此对于致病菌的检测是至关重要的。巴塞罗那自治大学的Jos´e Juan Rodríguez-Jerez教授团队通过实时荧光定量PCR检测干燥条件下粘附在不锈钢表面的鼠伤寒沙门氏菌和单核增生李斯特菌的能力，并与常规方法进行比较。相关文章以“Detection by real-time PCR and conventional culture of Salmonella Typhimurium and Listeria monocytogenes adhered to stainless steel surfaces under dry conditions”发表于《 Food Control 》。

通过实时荧光定量PCR获得的Ct值和TSAYE中的活细胞计数之间观察到了高度相关性（R 2=0.9718，p