SARS

严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染引起的2019冠状病毒病(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是21世纪世界范围内的第3次冠状病毒大流行。世界卫生组织2020年10月13日公布的统计数据显示，全球200多个国家和地区的COVID-19患者数为37 423 660，死亡人数达到1 074 817[1]，全球的疫情防控形势依旧十分严峻。SARS-CoV-2具有传染性强、潜伏期长、人群普遍易感、传播途径广泛、感染早期症状不明显且存在无症状感染者等特点[2-5]。这些特点赋予了该病毒在人群中高效、隐蔽传播的能力，加大了疫情防控的难度。

由于缺乏针对COVID-19的特效药物和疫苗，目前只能采取核酸检测排查、隔离病患、佩戴医用外科口罩等手段切断病毒的传播。尽管这些方法在短期内能有效地遏止SARS-CoV-2的传播，但从长远来看，通过疫苗的接种使人群获得对SARS-CoV-2的特异性免疫才是阻止COVID-19蔓延的最有效手段。本文将基于不同来源抗体对模型动物的保护作用、SARS-CoV-2抗原表位分析等基础研究探讨疫苗研发的可行性，对不同研发路线疫苗的优缺点进行分析并讨论相关疫苗发展应用中可能存在的风险与挑战。

冠状病毒疫苗的研发具有较大难度，至今仍未研制出针对某种冠状病毒的有效疫苗[6]，但许多研究表明，SARS-CoV-2疫苗具备研发的可行性。

首先，绝大多数COVID-19患者体内产生了针对SARS-CoV-2的中和抗体，这些抗体具有临床治疗COVID-19和预防SARS-CoV-2入侵的能力。有研究利用中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)表达来源于恢复期患者血浆的重组抗体，对具有宽效价范围的200多种抗体进行进一步筛选，得到9种与SARS-CoV-2刺突蛋白(Spike Protein，S)受体结合域(Receptor Binding Domain，RBD)具有强结合能力的单克隆抗体，这些抗体通过与病毒S蛋白RBD区域的结合阻止病毒与受体血管紧张素转换酶2 (Angiotensin-Converting Enzyme 2，ACE2)的相互作用，使病毒无法入侵宿主细胞[7]。卫健委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》(试行第4版)首次提出了恢复期血浆治疗的方案，该方案能在一定程度上缓解COVID-19患者的病情，说明恢复期患者血浆中的抗体具有治疗COVID-19的能力[8-9]。另一方面，多项体内实验证明，恢复期患者血浆的中和抗体可预防SARS-CoV-2的感染。利用高通量单细胞测序和VDJ测序技术对COVID-19患者产生的抗体进行高效筛选，发现靶向RBD区域的中和抗体BD-368-2在SARS-CoV-2暴露前后的接种将对小鼠产生不同的影响[10]。提前接种可完全抑制病毒的感染，而感染后接种也有效降低了小鼠体内SARS-CoV-2的滴度并减轻小鼠因感染产生的病变，提示COVID-19患者血浆分离的抗体具有预防感染及临床治疗的双重功能[10]。此外，Rogers等发现，针对S蛋白不同表位产生的中和抗体均具有上述功能，说明人体免疫系统可产生多种具有保护和治疗能力的中和抗体[11]。

其次，COVID-19患者会出现与感染严重程度相关的T细胞减少、衰竭及T细胞多样性降低的现象，提示SARS-CoV-2可对T细胞介导的免疫应答产生影响[6, 9]。

综上所述，天然SARS-CoV-2病毒拥有较强的免疫原性，其入侵可诱导人体产生强烈且特异的体液免疫和细胞免疫。多种针对不同抗原表位的中和抗体均具有预防病毒入侵及中和体内活病毒的能力，进一步揭示了人体免疫系统产生的特异性免疫具有潜在的保护作用。

表位是决定抗原分子特异性的特殊化学基团，B细胞表位是特异性抗体识别的区域[12]。明确SARS-CoV-2的抗原表位不仅有助于病毒致病机理和抗原-抗体相互作用机制等理论研究的深入，而且能为疫苗的研发设计打下坚实的基础。

为保证筛选得到的抗原表位的可靠性和特异性，需根据抗原蛋白的理化性质、空间结构和潜在的翻译后修饰位点等信息对胞内区、跨膜区、蛋白三维空间结构内部等不易触及区域和拥有较大空间位阻的翻译后修饰位点进行排除，以获得易识别、可及性高且长度与天然抗体识别长度相匹配的抗原肽段[13-14]。利用信息学工具对抗原蛋白的理化性质和结构特征进行分析，并根据分析结果对抗原蛋白的潜在表位进行预测是目前研究SARS-CoV-2表位的主要手段。研究者通过ProtParam、ExPAST、ProtScale等工具分析抗原蛋白的消光系数、不稳定系数和极性等理化性质，再分别通过SingnalP 5.0、TMHMM2.0、NetPhos 3.1等软件对抗原蛋白潜在的信号肽、跨膜区和磷酸化位点进行预测，进一步利用PSIPRED、SWISS- MODEL和PyMOL等软件预测其二级结构和三级结构，综合以上信息并通过DNASTAR、ABCpred、Beprpred、ElliPro、DiscoTope、SEPPA、IEDB等工具预测抗原蛋白潜在的B细胞表位和T细胞表位[12, 14-15]。

SARS-CoV-2拥有典型的冠状病毒基因结构，该病毒基因组的开放阅读框依次(从5′→3′的顺序)编码病毒的复制酶系(ORF 1ab)、S蛋白、包膜蛋白(Envelope Protein，E)、膜蛋白(Membrane Protein，M)和核衣壳蛋白(Nucleoprotein，N)[3, 16-17]。由于S蛋白具有较强的免疫原性且该蛋白S1亚基介导的受体结合过程和S2亚基介导的膜融合过程是SARS-CoV-2特异性入侵宿主细胞的关键[18-19]，针对S蛋白进行的表位分析是SARS-CoV-2抗原表位研究的热点。简春利等的研究结果显示，SARS-CoV-2的S蛋白二级结构环区中存在以QLPP和RARS为代表的适合抗体识别的短肽表位[14]。朱珊丽等的研究指出，SARS-CoV-2 S蛋白二级结构的柔性区域以无规则卷曲为主，该蛋白含有8个潜在的B细胞表位且由437-445、454-471位氨基酸残基构成的表位位于该蛋白的RBD区[20]。伦永志等的研究指出，SARS-CoV-2 S蛋白的B细胞表位主要位于该蛋白的S1亚基，辅助T细胞表位主要位于S2亚基；SARS-CoV-2及SARS-CoV的S蛋白氨基酸序列比对分析结果显示，2种病毒的S蛋白拥有相近的理化性质和结构特征，其中SARS-CoV-2的S蛋白600-605、695-703和888-896位氨基酸残基构成的抗原表位与SARS-CoV对应区域高度一致，提示了冠状病毒可能拥有保守的抗原表位[13]。许志强等结合多个软件的预测结果初步筛选出31个位于S蛋白的线性表位和9个构象表位，再根据SARS-CoV体内实验验证的具有中和抗体诱导能力的表位区域对初筛得到的结果进行进一步筛选，得到11个线性表位和5个构象表位[12]。这些表位均位于S蛋白的RBD区且具有诱导免疫系统产生中和抗体的能力，以这些表位为靶点设计的疫苗可诱导免疫系统产生针对病毒RBD区域的中和抗体，通过抗体的中和作用阻断S蛋白与受体ACE2的结合，从而达到保护接种者的目的。

值得注意的是，SARS-CoV-2存在大量的糖基化位点。SARS-CoV-2的S蛋白糖基化测定结果显示，该蛋白至少存在22个N连接的糖基化位点[21-22]。病毒蛋白的糖基化修饰被认为是病毒逃避宿主免疫系统识别和攻击的一种逃逸机制[14, 23]。一方面，糖链的空间位阻和糖链与抗原蛋白氨基酸残基内部的相互作用将改变抗原表位的空间结构和暴露方式，使宿主的免疫系统无法识别原有的抗原表位；另一方面，糖链可保护抗原肽段免受宿主蛋白酶的识别降解，导致宿主免疫系统无法对相关抗原产生有效的免疫应答[23]。因此，SARS-CoV-2抗原表位预测的相关研究应充分考虑抗原糖基化修饰的影响。对上述研究得到的不含糖基化修饰的抗原表位进行汇总，发现SARS-CoV-2的S蛋白525-540、674-689、806-818位氨基酸残基构成的抗原肽段是公认的抗原表位[12-14, 20]。这些肽段具有较强的免疫原性和可接触性，是理想的中和抗体结合位点。

此外，高度保守且功能多样的3C样蛋白酶同样受到了研究者的关注[24-25]。3C样蛋白酶抗原表位的预测结果显示，该蛋白的92-101、101-107、119-125、170-180、186-199位氨基酸残基构成的肽段是潜在的B细胞表位[24-25]。冠状病毒的3C样蛋白酶具有裂解复制酶多肽(pp1a或pp1ab)为成熟蛋白、指导RNA复制转录和参与多种结构蛋白加工组装等生物学功能[24]。抗体与3C样蛋白酶的结合将直接干扰该蛋白生物学功能的行使，使病毒因无法正常进行复制和组装而失去感染力。此类针对SARS-CoV-2重要功能蛋白进行疫苗设计的思路十分值得尝试。

利用生物信息学手段对SARS-CoV-2抗原表位进行预测可降低相关实验研究的工作量，为疫苗的研发争取到宝贵的时间，但该方法也存在一定的局限性：(1)不同分析工具预测得到的结果因软件内部算法的差异而各不相同，难以得到一致的结论。(2)基于少量样本得到的预测结果不能有效地反映SARS-CoV-2潜在表位的真实情况。SARS-CoV-2基因组中至少存在6 754个单碱基多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)位点[26]，SNP引起的核苷酸变化会改变其编码蛋白的氨基酸组成，进而影响抗原蛋白的理化性质和结构特征。以D614G为代表的氨基酸变异改变了S蛋白各亚基的接触方式并引起了相关抗原表位构象的变化[26]。因此，需要尽可能多地分析SARS-CoV-2基因组序列并明确关键位点SNP和突变对抗原蛋白结构的影响，再结合多个平台的预测和相关验证实验的结果对抗原表位进行筛选，以得到更全面、准确的结果。

灭活疫苗的研发路线相对成熟，只需得到具有免疫原性的易培养毒株便可实现疫苗的批量化生产[27]。但此类疫苗存在以下缺点：(1)灭活疫苗的免疫原性较弱，需多次接种才能诱导有效的免疫应答[27-28]。早期研究表明，灭活SARS-CoV可诱导小鼠产生较强的体液免疫反应，但小鼠CD4+、CD8+细胞的活性无明显提升，提示灭活冠状病毒疫苗诱导的细胞免疫应答较弱[29]。(2)灭活病毒的批量生产需先获得高浓度的活病毒，活病毒的培养存在较高的安全风险[29]。(3)灭活病毒可能含有诱导非中和抗体产生的抗原决定簇，具有引起抗体依赖增强效应(Antibody-Dependent Enhancement，ADE)的风险[30]。

Gao等的研究发现，灭活疫苗PicoVacc在多种模式生物体内均诱导出了具有广泛中和能力的特异性抗体，这些抗体主要针对SARS-CoV-2的S蛋白和N蛋白上的抗原表位[31]。进一步研究发现，针对S蛋白的特异性IgG抗体的浓度是针对N蛋白IgG抗体的30倍，说明灭活SARS-CoV-2病毒的有效表位主要集中在S蛋白[31]。值得注意的是，ADE现象并未在接种该疫苗的模式生物中出现，提示该疫苗在具备免疫原性的同时具有较高的安全性[31]。目前该疫苗已在巴西开展Ⅲ期临床试验，在评估该疫苗的免疫原性和安全性的同时，将对疫苗的接种者进行长达一年的随访，以进一步评估该疫苗能否提供长效的保护[32-33]。此外，登记号为ChiCTR2000031809和ChiCTR2000032459的SARS-CoV-2灭活疫苗也将进入Ⅰ/Ⅱ期临床试验，相关试验的结果同样令人期待[34]。

减毒毒株具有与野生型毒株高度相似的感染模式，单次接种即可诱导强烈且持久的免疫应答，所以此类疫苗已在多种传染病的预防中得到应用[9, 27]。但是减毒活疫苗潜在的生物安全风险制约了此类疫苗在SARS-CoV-2防治中的应用：(1)目前尚未建立SARS-CoV-2减毒毒株残余毒力评价的安全标准，难以评判某一毒株是否完全失去致病性[27]。(2)冠状病毒减毒毒株具有回复突变的潜力。已有研究证实，接种至小鼠体内的SARS-CoV减毒毒株可重新表达具有致病力的毒蛋白，提示减毒冠状病毒仍具备感染接种者的能力[35]。

病毒载体疫苗具有天然的黏膜嗜性，在刺激机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答的同时诱导强烈的黏膜免疫反应[29, 36]。目前，以腺病毒载体疫苗Ad5-CoV和ChAdOx1 nCoV-19为代表的SARS-CoV-2病毒载体疫苗取得了一定的突破。Ⅰ期临床试验的结果显示，Ad5-CoV可诱导大多数接种者产生有效的免疫应答，受试者体内特异性中和抗体的浓度在接种14 d显著上升并在接种后28 d达到峰值，特异性T细胞免疫应答也在接种后2周达到峰值[37]。尽管Ⅰ、Ⅱ期临床试验的结果表明Ad5-CoV具有较强的免疫原性和较高的安全性，但广泛存在的针对Ad5病毒的预存免疫是该疫苗发展应用所面临的首要障碍[36]。腺病毒广泛存在于自然界且不同血清型毒株之间存在广泛的免疫交叉反应，个体一旦受到天然腺病毒的感染，就极易产生针对疫苗载体的免疫记忆[36]。Ad5-CoV Ⅰ、Ⅱ期临床试验结果指出，约一半受试者体内存在较强的针对Ad5病毒载体的预存免疫，而且高浓度Ad5抗体的存在会对疫苗的免疫效果产生负面影响[37-38]。Ⅱ期临床试验的结果进一步发现，对于具有Ad5暴露史的人群，尤其是55岁以上人群，单次接种并不足以诱导足够高水平的体液免疫，提示了该疫苗在具有Ad5暴露史的人群中无法发挥最佳的免疫效果[37-38]。

为保证该疫苗的有效性，可通过以下手段降低预存免疫的影响：(1)可对现有的病毒载体进行更换，利用如Ad11或Ad35等稀有血清型毒株作为替代载体，降低载体病毒被免疫系统清除的概率[39]。(2)可提前检测接种者体内预存免疫的种类及强度，并根据检测的结果接种适合的疫苗。(3)在疫苗接种后的3-6个月进行二次接种也是减轻预存免疫影响的潜在解决方案[38]。

另一种编码S蛋白的重组腺病毒载体疫苗ChAdOx1 nCoV-19同样进入了Ⅲ期临床试验。该疫苗的临床前试验表明，ChAdOx1 nCoV-19的接种可诱导小鼠和恒河猴产生特异性中和抗体及强烈的Th1型细胞免疫应答[40]。在Ⅰ/Ⅱ期临床试验中，ChAdOx1 nCoV-19接种后7 d便诱导出了相应的T细胞免疫应答并在接种后的14 d达到峰值；特异性体液免疫水平在接种后的28 d出现显著增加且二次免疫有利于抗体水平的进一步提升[41]。值得注意的是，只有约1%的受试者体内含有较强的针对ChAdOx1载体的预存免疫，而且低水平的预存免疫并不会影响疫苗的免疫效果，提示该疫苗能在大多数人体内发挥最佳的免疫效果[41]。目前，尚未明确该疫苗对55岁以上的人群和12岁以下的儿童是否具有相同的保护作用，因此该疫苗的Ⅲ期临床试验将招募55岁以上的老年人和5-12岁的儿童作为志愿者[42]。

目前，以INO-4800为代表的SARS-CoV-2 DNA疫苗的研发取得了一定进展。经体外转染实验验证具有S蛋白表达能力的INO-4800可诱导小鼠和豚鼠产生针对SARS-CoV-2 S蛋白的特异性中和抗体和相应的T细胞应答，提示了INO-4800可利用宿主的细胞表达具有免疫原性的S抗原[18, 43]。该疫苗Ⅰ期临床试验的结果显示，INO-4800不会引起明显的不良反应，接种2次后94%的受试者产生了有效的免疫应答，提示该疫苗具有保护大多数接种者免受SARS-CoV-2感染的潜力。此外，针对S蛋白设计的口服DNA疫苗bacTRL-Spike是首款口服DNA疫苗，该疫苗不但能有效解决DNA疫苗接种效果差、接种痛感高等问题，而且具备诱导粘膜免疫应答的潜力，其临床试验的结果值得期待[29, 32]。

安全性问题是制约人用DNA疫苗发展的核心问题，此类疫苗主要存在3个方面的风险：(1)部分DNA载体具有与宿主基因组整合的能力，外源DNA的插入可能会造成宿主原癌基因活化或抑癌基因失活，具有潜在的致癌风险[27, 44]。(2) DNA疫苗诱导宿主细胞持续少量地表达抗原蛋白，易造成免疫系统错误地将抗原蛋白识别为自身蛋白，从而形成免疫耐受[22]。(3)用于载体阳性重组子筛选的抗生素抗性标记的导入可能会造成接种者产生针对此类抗生素的耐药性。因此，在明确疫苗保护效果和接种副作用的同时，还需对上述DNA疫苗接种可能引发的安全性问题进行深入研究。

与DNA疫苗相比，编码抗原的mRNA无需进入宿主细胞的细胞核，保证了疫苗的安全性[45]。以全长S蛋白为靶抗原的mRNA-1273可诱导接种者产生具有剂量相关性的免疫应答；该疫苗二次接种后的2周，接种剂量为25 μg的低剂量接种者的体内可产生与恢复期患者相当的抗体水平，说明mRNA-1273可诱导人体产生较强的体液免疫应答[34, 45]。该疫苗利用脂质纳米颗粒作为mRNA的递送载体，在减轻mRNA与细胞膜磷脂双分子层静电排斥的同时增加了mRNA的稳定性，提高了疫苗的递送效率[27, 34]。ShaCoVacc研发的针对SARS-CoV-2不同抗原的mRNA疫苗可诱导小鼠产生具有高效中和作用的特异性抗体，此类针对多个抗原靶点设计的mRNA疫苗能有效防止SARS-CoV-2逃逸突变体的产生，具有更为稳定的保护能力[34, 46]。疫苗稳定性差、缺乏长效保护力和难以引起有效的T细胞免疫应答是mRNA疫苗的主要缺点，因此，mRNA-1273的Ⅲ期临床试验将对该疫苗的有效性和安全性进行长达2年的深入评估，以确保疫苗具有长效保护力[47-48]。

选择合适的蛋白表达系统生产目的抗原，再对得到的表达产物进行分离纯化是重组蛋白疫苗研发的基本步骤[27]。天然SARS-CoV-2抗原蛋白存在较多的糖基化位点，为保证表达产物的三维空间结构尽可能地与天然抗原相似，通常利用CHO细胞或昆虫细胞作为SARS-CoV-2抗原的表达系统[18, 27]。徐铮昊等利用CHO细胞对抗原S1和人IgG1 Fc段的融合蛋白(S1-hFc)进行表达，并对S1-hFc和DNA疫苗PVRC-RBD-mFc (编码RBD区域和小鼠IgG1 Fc融合蛋白的质粒)接种的免疫效果进行比较，发现S1-hFc诱导的特异性体液免疫应答水平较PVRC-RBD-mFc更高，而且该疫苗产生的抗体具有更强的中和能力[49]。Yang等利用昆虫杆状病毒表达载体Bac-to-bac对S蛋白的319-545位残基构成的片段进行了表达，该重组蛋白能诱导小鼠、兔子和恒河猴等多种模式生物产生有效的体液免疫应答，免疫动物的血清能阻断病毒与受体ACE 2的结合并中和SARS-CoV-2活病毒[50]。

尽管体内实验的结果显示了重组蛋白疫苗具有良好的免疫原性和较高的安全性，但CHO细胞和昆虫细胞为代表的真核动物细胞表达系统大多存在细胞培养成本高、蛋白表达效率低、产物纯化繁琐等缺点，限制了重组蛋白的工业化生产[51-52]。分泌型毕赤酵母表达系统可在诱导型启动子PAOX1的严格调控下稳定高效地分泌具有真核细胞翻译后修饰的重组蛋白。毕赤酵母表达系统具有广泛的适应性，多种不同来源的蛋白质在该系统中得到成功表达，提示该系统具有批量化生产SARS-CoV-2抗原蛋白的潜力。

SARS-CoV-2和SARS-CoV同为β-冠状病毒且二者基因组的相似性高达79%，提示这2种病毒大概率存在较多的交叉表位[53-54]。因此，在SARS-CoV早期研究筛选得到的中和抗体库中寻找具有SARS-CoV-2中和能力的抗体，并根据这些抗体结合的抗原表位设计疫苗被认为是SARS-CoV-2疫苗开发最快捷有效的策略。此类疫苗不但具有开发成本低、研发周期短等优势，而且具有保护接种者免受今后可能出现的其他冠状病毒感染的潜力，对时下COVID-19蔓延的阻止和今后可能出现的冠状病毒疫情的防控均体现出较高的应用价值。

这2种病毒对应表位关键氨基酸残基的差异程度决定了针对这些位点产生的中和抗体能否产生有效的交叉反应。多项研究指出，大多数针对SARS-CoV的S蛋白及其RBD区域产生的中和抗体(如CR3014、m396、S230、80R)对SARS-CoV-2无明显的交叉作用及中和活性[18, 55-56]。该现象可能与二者RBD区域的6个关键氨基酸残基有5个不同相关[54, 57]。Yi等根据SARS-CoV对应位点的氨基酸信息分别对SARS-CoV-2的RBD区域内与ACE2相互作用的关键残基进行突变，发现这种替换将对SARS-CoV-2与ACE2的结合能力产生巨大影响[58]。该结果验证了S蛋白RBD区域关键氨基酸残基的差异是大部分抗体无法产生交叉反应的关键，而另一方面，针对保守程度较高位点产生的抗体则表现出更好的交叉反应能力[59]。来源于康复SARS-CoV患者血浆的中和抗体CR3022能与SARS-CoV-2的S蛋白RBD区域发生交叉反应；进一步分析发现，该抗体识别的28个氨基酸残基中的24个在两种病毒间保守，但非保守位点和翻译后修饰的差异使得该抗体与SARS-CoV-2的亲和力远低于SARS-CoV[53]。Tai等从SARS-CoV RBD特异性中和抗体库中筛选出6个与SARS-CoV-2 S蛋白发生交叉反应的单克隆抗体，其中7B11和18F3具有中和SARS-CoV-2的能力，它们识别的表位也都具有较高的保守性[60]。

具有交叉中和能力的抗体大多作用于病毒的保守表位。但要注意的是，能与S蛋白发生交叉反应并不等同于该抗体对全病毒具有中和作用。有研究指出，SARS和COVID-19康复患者的血浆中均存在能与不同病毒S蛋白发生交叉反应的抗体，但这些抗体无法中和另一种全病毒[56]。该现象说明尽管某些抗原蛋白在离体条件下具有相似的空间结构和抗原性，但当它们分别位于不同病毒颗粒的时候，这种相似的性质会因为抗原与病毒颗粒其他成分的相互作用或受到不同的翻译后修饰而改变。因此，针对不同病毒颗粒的交叉中和能力才是衡量筛选得到的交叉抗体及其对应保守表位是否具有疫苗设计潜力的金标准。

SARS-CoV-2较高的变异速率是相关疫苗研发的一个巨大挑战，病毒核苷酸序列的变异将造成相关编码蛋白的一级结构发生变化，进而影响蛋白质的空间结构和生物学功能[61-62]。当变异累积到一定程度后，早期研发的疫苗便可能无法保护接种者免受新生代毒株的感染[18]。目前已有研究指出，SARS-CoV-2基因组特定位点的突变将引起病毒进化。Tang等根据SARS-CoV-2基因组的8 782位和28 192位关联性SNP将毒株分为S和L这2个亚型，并通过突变前后基因表达产物的功能性分析得到新出现的L型毒株具有更强传播能力的结论[54]。另一项研究指出，2020年1月下旬首次发现的D614G毒株的分离频率在逐步上升，目前该毒株占全球新分离毒株的97%以上，提示D614G已成为全球范围内的主要流行毒株[26]。对该突变位点的分析发现，D614G变异可提升SARS-CoV-2的感染力和病毒载量，更利于病毒在人群的传播[26]。尽管早期筛选得到的SARS-CoV-2单克隆抗体仍能有效中和D614G突变株，但今后可能出现的位于疫苗作用位点的突变应值得警惕[26]。此外，病毒在不同中间宿主体内发生的遗传重组也是毒株变异进化的重要手段[13]。COVID-19的全球大流行将不可避免地造成大量动物充当SARS-CoV-2中间宿主的角色，更为复杂、多变的传播网络将进一步提升毒株进化速率，为疫苗的研发带来新的挑战[17, 62-64]。

为保证疫苗的有效性，必须加强不同生物来源毒株的序列分析，明确当下流行毒株和其他生物体内毒株的差别并对病毒的进化方向作出判断，做到对未知表型毒株的提前防范。

疫苗诱导产生的中和抗体对接种者具有保护作用，但中和抗体的存在也可能会增加SARS-CoV-2逃逸突变概率[65]。有研究指出，单一抗体或竞争性抗体(结合同一位点的不同抗体)的存在无法阻止逃逸突变体的产生，而非竞争性抗体能很好地保护细胞免受SARS-CoV-2的感染[46]。以上结果表明，抗体带来的选择压力会驱动病毒产生相应的逃逸突变，针对单一表位设计的疫苗仅能提供有限的保护力。多项研究证实，同时作用于SARS-CoV-2多个关键表位的混合抗体能有效阻止病毒的逃逸，根据这些抗体对应表位设计的疫苗拥有更加稳定的保护能力[45-46, 66]。

回复突变等生物安全问题制约了冠状病毒减毒活疫苗的发展。早期关于SARS-CoV回复突变潜力的研究发现，全长E基因删除的SARS-CoV减毒毒株可在体内外传代的过程中恢复毒力[67]。研究者对SARS-CoV的E基因进行了不同程度的缺失突变，发现该病毒主要通过插入新型嵌合蛋白或将PBM基序(E蛋白C末端关键部分)插入8a蛋白、E蛋白(部分缺失)等原有编码等方式恢复毒力[67]。在E基因仅出现PBM基序缺失的情况下，SARS-CoV倾向于通过在编码自身蛋白的基因中插入编码PBM基序序列的方式恢复PBM的生物学功能；当E基因完全缺失或无法恢复时，缺陷型SARS-CoV毒株则通过具有补偿E基因生物学功能的新型嵌合蛋白的产生来恢复自身毒力[67]。值得注意的是，SARS-CoV减毒株在不同细胞系中产生的嵌合蛋白有所不同，提示了冠状病毒的逃逸机制具有宿主特异性[67]。尽管可以通过多个抗原基因同时突变的方式降低减毒毒株回复突变的概率，但鉴于SARS-CoV-2在人体内的逃逸机制尚未明确，减毒活疫苗的接种仍具有较高的安全风险。

ADE现象指的是抗体与病毒颗粒结合形成的免疫复合物被表达Fc受体或补体受体的靶细胞识别结合，使病毒颗粒能感染此类不含天然病毒受体的细胞，进而加重宿主的感染[28, 30, 68]。多项研究已经证实，包括SARS-CoV和MERS-CoV在内的多种病毒存在ADE现象[34, 50, 68-69]。

对表达Fcγ受体细胞的增强作用和对表达补体受体细胞的增强作用是ADE引发感染加剧的主要机制。一方面，免疫复合物抗体的Fc区域与免疫细胞Fcγ受体的结合会导致病毒颗粒进入免疫细胞，通过IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、TNF-γ、INF-α等细胞因子下调和STAT通路的抑制破坏宿主的免疫应答；另一方面，免疫复合物与C1q的结合将活化补体系统，通过C2a、C4b的招募产生具有活性的C3转移酶并水解C3，水解产物C3b进一步与病毒结合形成病毒-C3b复合物，该复合物被补体受体识别后将引发细胞裂解，从而加重感染[68]。

免疫复合物的形成是以上过程发生的共同起始步骤，非中和抗体与抗原的结合被认为是此类引发ADE效应的免疫复合物形成的基础[6, 28, 49]。因此，选择仅诱导中和抗体产生的抗原表位进行疫苗设计可有效防止ADE的发生[49]。多项研究表明，SARS-CoV-2全长N蛋白、S蛋白等抗原蛋白具有诱导非中和抗体产生的潜力；S1蛋白、RBD蛋白等含有优势中和表位的抗原片段能高效诱导中和抗体产生，但这些片段的高变异率限制了相关疫苗的发展[6, 10-11, 55]。因此，可以结合生物信息学分析及中和实验的结果对现有的SARS-CoV-2单克隆抗体库进行筛选，寻找与含有优势中和表位的保守抗原片段结合的抗体并根据这些抗体设计无ADE风险的疫苗。

此外，有研究发现稀释倍数较低的恢复期SARS患者血清可有效中和SARS-CoV，但高稀释倍数的同一血清却会引起更高水平的细胞凋亡[69]。该结果提示ADE的发生可能与中和抗体的保护能力有关，当中和抗体达到或高于有效保护浓度时，非中和抗体引发的ADE感染将被中和抗体的强中和作用消除。也就是说，尽管接种某些疫苗有诱导ADE发生的风险，但这种风险会因为中和抗体的存在而大幅降低。

SARS康复患者的回顾性研究指出，康复患者体内缺乏针对SARS-CoV的长效免疫记忆[35, 70-71]。特异性抗体的平均维持时间为2年，从第3年开始抗体的效价及阳性率出现显著降低，第6年的检出率低于10%[70-71]。该结果说明SARS-CoV自然感染诱导的免疫应答仅能维持3年，此后仍有再次感染的风险。因此，需要对COVID-19患者体内的免疫应答水平进行长期追踪，明确人体免疫系统是否缺乏针对SARS-CoV-2的长效免疫记忆，为疫苗接种策略的制定打下坚实的基础。

疫苗的接种被认为是阻止时下COVID-19疫情进一步蔓延的最有效手段。基于生物信息学手段进行的抗原表位预测是疫苗研发的基础，随着SARS-CoV-2基因组序列研究的深入，更多位于SARS-CoV-2不同基因的潜在表位将被发现，寻找保守性高且仅诱导中和抗体产生表位将是今后相关研究的重点。

多条技术路线同时开展并在研发的过程中评估疫苗的安全性和有效性，可为SARS-CoV-2疫苗的研制争取到宝贵的时间。目前，多条疫苗研发的技术路线均取得了一定的进展，它们各自的优缺点也在研发的过程中得到体现。病毒变异及免疫系统引起的疫苗有效性问题和疫苗接种潜在的安全性问题制约了相关疫苗的应用。为了提高相关疫苗的有效性和安全性，我们还需要对以下问题进行深入研究：(1)对不同国家地区及不同生物来源的SARS-CoV-2毒株的序列进行分析比对，明确此前设计的疫苗能否保护接种者免受当下流行毒株及潜在流行毒株的感染。(2)进一步明确SARS-CoV-2在人体内的逃逸机制和ADE引发机制，并探究作用于多个抗原表位的“鸡尾酒抗体”和针对保守表位产生的中和抗体能否有效阻止病毒的逃逸及ADE的产生。(3)需要对疫苗接种者和COVID-19康复者体内的免疫应答水平进行长期追踪，明确疫苗的保护时长并根据免疫记忆的特点制定合适的疫苗接种策略。