肠道沙门氏菌O

沙门菌是兼性厌氧革兰氏阴性细菌，分为邦戈尔沙门氏菌(Salmonella bongori)和肠道沙门氏菌(Salmonella enterica, S. enterica)两个种，后者能够引起人类、哺乳类、鸟类、爬行类等多种动物的食物源性人畜共患病[1]，主要表现为发热、肠炎、败血症等症状，严重威胁着人畜的健康[2]。本文主要讲述致病性肠道沙门氏菌(S. enterica) O-抗原多糖的研究进展。

O-抗原多糖是沙门菌脂多糖的重要组成成分，由重复的寡糖单元组成，呈链状结构表达于细胞外膜[3]。它是沙门菌最多变的细胞组分，其多样性表现为组成的单糖种类、空间结构上的顺序及糖键的不同。O-抗原的多样性是在宿主免疫系统、噬菌体及其他环境因素的长期选择压力下逐步形成的，成为划分血清型的重要依据，同时对沙门菌群体的存活也意义重大[4-5]。O-抗原与细菌的致病性密切相关，是沙门菌的主要毒力因子[6]，缺乏O-抗原能显著降低细菌的毒力[7]。研究表明，它参与沙门菌一系列的生物学过程，包括维持细胞外膜的稳定性、信号识别、入侵和定殖及免疫逃避等[8]。此外，O-抗原多糖具有良好的免疫原性，是一种主要的保护性抗原[9]，其特异性抗体能够有效阻止和清除细菌的入侵与感染，因而已成为研制沙门菌疫苗的重要靶抗原[10]。本文从O-抗原多糖的合成、参与的生物学过程及其在疫苗研制中的应用三个方面系统阐述O-抗原多糖的研究进展。

O-抗原多糖由寡糖重复单位组成(几个到几十个)，每个重复单位通常由2到8个单糖组成，形成有分枝或无分枝的链状结构。以鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)为例，其寡糖单位由4个单糖组成，分别为半乳糖、甘露糖、阿比可糖、鼠李糖。WHO沙门菌参考和研究合作中心及巴斯德研究所公布的KW抗原分型系统(Kauffmann-White-Le Minor serotyping scheme)是目前通用的沙门菌血清型分类方法，其中包括46种O-抗原和114种H-抗原，O-抗原以数字或字母表示[11]。根据O-抗原将沙门菌划分为不同的血清群，在此基础上结合H-抗原再划分为不同的血清型，目前分离鉴定的血清型达2 557个[11]。肠道沙门氏菌(S. enterica)分为6个亚种：S. enterica subsp. enterica，S. enterica subsp. salamae，S. enterica subsp. arizonae，S. enterica subsp. diarizonae，S. enterica subsp. houtenae，S. enterica subsp. indica，其中S. enterica subsp. enterica涵盖约60%的血清型，也是最常见的引发沙门氏菌病的一个重要亚种[4]。

此外，根据链的长短，一般可粗略地将O-抗原多糖链分为长型(> 100个重复糖单位)、中间型(16-35个重复糖单位)和短型(1-15个重复糖单位)[12-13]。依据起始的糖还可分为N-乙酰葡萄糖胺起始的O-抗原和N-乙酰半乳糖胺起始的O-抗原，而大多数致病性沙门菌的O-抗原属于后一种[4]。由于构成重复单位的单糖种类和排列顺序、多糖链的空间结构及侧链的有无等存在异质性，因而O-抗原具有高度的多样性(图 1)。不同血清型的沙门菌拥有不同的O-抗原结构，而参与合成O-抗原的基因是造成其多样性的决定因素[14]。图 1所示为4种流行性血清群C2、B1、A、D1的O-抗原化学结构，其中B1、A、D1的O-多糖重复单位的主干糖组成一致，主要区别在于侧糖不同，分别为阿比可糖、泊雷糖、泰威糖；而C2的O-多糖的主干糖由半乳糖-甘露糖-甘露糖-鼠李糖组成，比其余3种O-多糖多了一个甘露糖。

研究证实，O-抗原多糖的合成是多基因协调作用的结果，这些基因一般成簇存在，形成O-抗原基因簇，通常位于基因组的galF和gnd基因位点之间[15]。O-抗原基因簇通常由3种基因组成：单糖合成基因、糖基转移基因和寡糖单位处理基因(图 2)[16]。单糖合成基因通常是保守的，负责合成仅在O-抗原中存在的罕见糖，如甘露糖、鼠李糖，而O-抗原中的常见糖，如葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺等，则通常由位于基因簇外的其它基因负责合成[4]。糖基转移基因负责将单糖转移到一个固定在细胞内膜胞质侧的Undp脂质载体上，在内膜的胞质侧合成寡糖单位[3, 17]。寡糖单位处理基因负责合成O-抗原转运酶和聚合酶，完成O-抗原的加工和转运。沙门菌O-抗原的合成和转运由3种不同的通路所介导，包括Wzx/Wzy途径、ATP-binding cassette (ABC)途径和合酶途径。几乎所有血清型的沙门菌O-抗原合成由Wzx/Wzy途径所介导，但O67和O54例外，分别由ABC途径和合酶途径介导[4, 18]。在Wzx/Wzy途径中，O-抗原中的寡糖单位通过翻转酶(Wzx)被转移到内膜周质侧，然后通过聚合酶(Wzy)聚合成多糖，再在O-抗原连接酶(WaaL)的作用下，将多糖连接到一个糖脂分子(类脂A和核心寡糖)上形成完整的脂多糖分子[19-20]。而ABC途径中，转移酶(WecA)催化形成起始的Undpp-GlcNAc，在细菌内膜胞质侧通过糖基转移酶连续将糖基转移到延伸的糖链的非还原端而多聚化，然后组装而成的多糖链在Wzm和Wzt两个蛋白的作用下，通过ABC转运系统转到膜外。合酶途径则由转移酶(WecA)催化形成起始的Undpp-GlcNAc，然后由糖基转移酶(WbbF和WbbE)催化多聚体的延伸，由于WbbF具有糖基转移酶和转运输出的双重功能，因而它还负责将合成的O-抗原转移至内膜外侧进行组装[4]。

O-抗原是沙门菌重要的致病因子，在沙门菌粘附与入侵[21]、肠道定殖[22]、免疫逃避[14]及体内存活，如血清敏感性[23]、对吞噬细胞的抵抗能力[24]、泳动能力[25]等诸多生物学过程中发挥显著作用。研究表明，粗糙型沙门菌(缺乏O-抗原链或O-抗原链减少)的泳动能力和定殖能力减弱，对血清补体和抗生素更加敏感，对吞噬细胞的抵抗能力也显著下降[7, 26-27]。链的长短对沙门菌的生物学特性也有一定的影响，缩短O-抗原链的长度可提升沙门菌对肠道上皮细胞的侵染能力，其机制可能是细菌表面多糖缺失或多糖链缩短使得细菌更容易接触细胞表面的粘附蛋白，从而增加了细菌对细胞粘附和入侵[7, 28]；长型和中间型O-抗原链则有助于沙门菌抵抗机体内的极度恶劣环境，包括有机酸、胆酸盐(如Deoxycholate)、抗菌肽(如多粘菌素B)，使细菌更容易定殖于肠道[29-31]；同时，拥有中间型O-多糖糖链的细菌能够有效抵抗补体和吞噬细胞的杀灭作用[31-32]；缺乏长型糖链对细菌抵抗补体和吞噬细胞的抵抗作用则影响不显著[33]，但能优化荚膜多糖(Vi多糖)的免疫逃避机制，这可能是伤寒沙门菌(Salmonella typhi)在长期的生存选择中失去长型O-抗原糖链的原因[34]。此外，O-抗原糖链分枝结构的有无对沙门菌的生物学特性也有重要影响，当缺失O-抗原侧链时，细菌对血清补体和抗菌肽的敏感性增加，泳动能力和肠道定殖能力也显著下降[35]。因此，O-抗原糖链的有无、长短及分支结构均对沙门菌的生物学特性具有重要影响，可见O-抗原在沙门菌完成其生活史过程中具有不可替代的重要作用。

研究表明，O-抗原具有良好的免疫原性，也是沙门菌主要的保护性抗原[36]，其特异性抗体与免疫保护息息相关[10]。野生型鼠伤寒沙门菌灭活苗免疫动物后，能够为小鼠和兔子提供保护力，且能产生高水平的O-抗原特异性抗体，而缺乏O-抗原的沙门菌灭活疫苗则无法提供保护[37]；O-抗原特异性IgA单克隆抗体(Sal4)，能够通过抑制鞭毛的功能而降低细菌的运动力、破坏细菌外膜的完整性，通过抑制毒力岛Ⅲ型分泌系统而降低细菌的侵染力，保护小鼠免受大剂量鼠伤寒沙门氏菌强毒株的感染[38]。

鉴于O-抗原在免疫保护中的重要作用，O-抗原成为亚单位疫苗研究领域的重要靶抗原，被认为可用于研制沙门菌多糖疫苗[39]。然而初期的研究表明，O-抗原单独存在时是一种半抗原，不能像伤寒沙门菌Vi多糖一样被单独制作成多糖疫苗，原因可能是O-抗原多糖相对于Vi多糖的分子量较低[39]。因而人们通过化学方法将O-多糖与载体蛋白共价结合，制备多糖-蛋白结合疫苗[40-41]。研究证实，通过化学方法1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP)将鞭毛蛋白与O-多糖连接而制备的多糖-蛋白结合疫苗能激发BALB/c小鼠和CD-1小鼠产生高水平的IgG抗体，能够抵抗超大剂量的肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)强毒株的感染，证明其具有良好的免疫保护效果[42]。同样，通过adipic acid dihydrazide (ADH)等化学方法，将鼠伤寒沙门菌的O-抗原多糖分别连接到新型蛋白载体白喉类毒素(Diphtheria toxoid，DT)和破伤风类毒素(Tetanus toxoid，TT)上制成的多糖-蛋白结合疫苗也被证实具有理想的免疫保护效果[43-44]。其它载体蛋白的发现，包括白喉毒素突变体交叉反应物质197 (Cross reacting material 197，CRMl97)、B群脑膜炎球菌外膜蛋白(GroupB meningococcal outer membrane protein，MenBOMP)、流感嗜血杆菌D蛋白、绿脓杆菌外毒素A (Pseudomonas aeruginosa exotoxin A，PEA)等[45]。虽然这些载体蛋白与O-抗原多糖结合的效果还不知道，但为O-抗原多糖疫苗的研制提供了更多可能性。这些结果预示着O-抗原多糖-蛋白结合疫苗具有广阔的应用前景。

O-抗原多糖是沙门菌细胞膜的重要组成成分，研究其基因结构和功能对剖析沙门菌这一重要人畜共患病原的致病机理具有重要推动作用。分析了解沙门氏菌O-抗原的分子基础、化学组成及合成过程，有利于揭示O-抗原多样性产生的机制，也有利于通过分子生物学的方法改变沙门菌O-抗原糖重复单位的结构或者O-抗原的大小，掌握O-抗原结构与细菌致病性之间的关系。随着测序及质谱技术的发展，大多数致病性沙门氏菌的O-抗原基因簇和化学组成已被揭示，这对血清型划分和流行病学调查具有重要意义[14]。然而，O-抗原多样性与细菌致病性之间的关系，即O-抗原结构或化学组成的不同对沙门菌毒力、定殖等生物学特性的影响还远远没有研究清楚。虽然现在已阐明O-多糖的有无、链的长短、分支结构等均影响着细菌的入侵、定殖等生物学特性，但此部分研究尚处于初始阶段，且仅局限在少数几种O-抗原上，具体的作用机制也还不清楚[4]，这需要以多种O-抗原为研究对象进行更广泛而深入的研究。此外，鉴于O-抗原具有免疫保护性，因而，如何精细调控O-多糖的结构使得细菌减毒的同时又保持其免疫保护性也应成为未来的重要研究内容。

疫苗是控制疾病发展最有效、最经济的手段。沙门菌对人类及动物的严重危害凸显了疫苗研究的急迫性，伤寒沙门菌Vi-多糖疫苗的商品化证明多糖疫苗具有广阔的应用前景。目前关于O-抗原多糖-蛋白结合疫苗的研究也证实O-多糖有望像Vi-多糖一样成为预防沙门菌的重要武器。然而，研制此种疫苗无法忽视的问题之一是蛋白载体的选择与使用。虽然蛋白载体能显著提高O-多糖抗原的免疫原性，但是同一载体蛋白的重复应用会出现争夺体内有限的载体特异性T淋巴细胞的现象，以及免疫产生的载体蛋白特异性抗体会结合接种抗原，从而影响免疫效果。同时，目前多糖-蛋白结合疫苗使用的载体蛋白含量较大，可能会引起超负荷或免疫抑制等问题[46]。因此，为满足疫苗需求，筛选新颖的、更高效及更安全的载体蛋白也是研制沙门菌O-抗原多糖疫苗需解决的关键科学问题。