乙酰胆碱受体的重组表达以及抗AChR抗体检测方法的建立

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作者：

林烨

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摘要：

重症肌无力(MG)是一种对神经肌接头处烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinicacetylcholinereceptor,nAChR)产生免疫反应的自身免疫性疾病.抗nAChR抗体激活的补体攻击反应可以导致nAChR甚至突触后膜的破坏,从而引起神经肌肉传导功能障碍. 烟碱型乙酰胆碱受体为配体门控离子通道超家族成员之一,在神经肌肉接头中的突触后膜上介导化学信号向电信号的快速转化.这一家族蛋白包括甘氨酸受体,γ-氨基丁酸受体,谷氨酸受体及5-羟色胺受体.电鳐电器官及骨骼肌中的nAChR为较大的(Mr约290kDa)四种同源亚基组成的五聚体,电鳐及胚胎肌肉中为α12β1δγ,成人肌肉中为α12β1δε.亚基按α1-γ-α1-δ-β1的顺序形成一个圆柱形离子通道复合体.每个亚基都是一条多肽链,从N端到C端依次为:1个较大的N-末端胞外域(extracellulardomain,ECD),3个跨膜域,1条较大的胞内环,第4个跨膜域和1个C-端尾位于胞外.nAChRN-末端胞外域对受体激动剂及竞争性拮抗剂都具有较高的亲和力.神经递质ACh主要作用在α1γ亚基和α1δ亚基交界处的两个不对等位点,而α-银环蛇毒素(α-Bungarotoxin,α-BTx)与nAChR的结合位点则主要是α1亚基N-末端胞外域.并且,α1亚单位胞外域还包括了主要免疫原区(mainimmunogenicregion,MIR),是刺激重症肌无力患者形成nAChR抗体的主要位点.外源注射nAChR能使动物产生nAChR抗体,并表现出重症肌无力症状,即免疫重症肌无力主动免疫动物模型.将来还有可能将nAChR用于结合重症肌无力患者血清内的致病抗体,从而达到去除致病抗体,缓解临床症状. 有研究称,利用放射免疫法(RIA)检测MG患者血清抗-AChR抗体含量,以此作为诊断标准,其诊断敏感性为88%,且不同MG分型的阳性率也有所区别:早发眼肌型MG为71%,晚发眼肌型为88%,早发全身型为89%,晚发全身型为98%.而抗-AChR抗体阳性诊断MG的特异性高达99.9%.但是,目前国内没有将检测抗-AChR抗体作为常规诊断方法,通过我们的研究,我们成功建立了稳定的抗-AChR抗体放射免疫检测法,并希望该方法能与临床诊断相结合,提高MG诊断效率. 实验性自身免疫性重症肌无力(Experimentalautoimmunemyastheniagravis,EAMG)是发生在大鼠身上的,T细胞依赖的抗体介导的自身免疫性疾病,且整个免疫过程是单纯针对nAChR的免疫反应.作为研究重症肌无力的重要研究手段,EAMG模型的构建依然是我们研究该领域的重要基础.目前构建EAMG模型的原材料主要有两种:一种是电鳐电器官,一种是哺乳动物的去神经支配肌肉.目前在国内,电鳐价格昂贵且难以获取,而大鼠去神经支配术复杂且获取量少,所以我们考虑用重组表达nAChR的方法获得稳定且具有生物学活性的蛋白.本实验共尝试了两种方法表达nAChR:CHO①细胞表达人乙酰胆碱受体α亚单位胞外域.以nAChRα1基因全长为模板,PCR法扩增nAChRα1亚基ECD1-216,酶切后装入pcDNA3.1表达载体中,脂质体转染入CHO细胞,分别在转染后6~72h的7个时间点进行荧光实时定量PCR鉴定ECD基因的表达水平,利用125I标记的银环蛇毒素测定细胞培养上清中ECD蛋白的表达.②大肠杆菌表达含三个突变碱基的大鼠乙酰胆碱受体α亚单位胞外域.将大鼠AChRα1亚基胞外域蛋白中三个氨基酸进行突变,分别为Val8Glu,Trp149Arg,Val155Ala,送公司合成上述基因.将合成基因插入pET-22b载体中,然后在Bl-21菌株中大量表达.鉴定表达正确的蛋白用溶液稀释法进行蛋白复性. 综上所述,本实验尝试可通过真核或原核细胞表达重组nAChR的方法来替代来源短缺的天然nAChR,同时建立快捷,简便的抗nAChR抗体检测方法,提高临床MG的诊断效率.

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关键词：

乙酰胆碱受体 重组表达 抗AChR抗体检测 重症肌无力

年份：

2013