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RNA干扰慢病毒稳定株筛选
2011-11-02 00:00
来源:上海生博
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小分子RNA干扰技术是一种特异性地阻断某些基因表达的研究手段,在肿瘤、病毒感染,遗传病及其它疾病的治疗中均有广泛应用。慢病毒载体是一类来源于重组逆转录病毒的载体,由于具有可以感染非分裂期与分裂期细胞,容纳大的外源性目的 基因片段,免疫反应小等特点,现已成为转移目的 基因进入哺乳动物细胞的理想载体。将慢病毒载体应用于RNA干扰当中,可以特异性抑制哺乳动物的各类细胞中基因的表达,成为基因功能研究和基因治疗的有力手段。目前研究表明慢病毒载体能在哺乳动物各类细胞稳定表达siRNA,长期抑制基因表达。为建立细胞模型后续基因治疗提供有效的研究手段。 生博目前为客户筛选过几百种基因的干扰片断,并通过慢病毒得到几十种稳定细胞株。为后续研究基因治疗提供了有效依据。 BXXX1基因干扰稳定HeLa细胞株构建 第一部分:BXXX1干扰载体构建(载体pMagic 4.1) siRNA设计: Marker gene Gene ID TargetSeq GC%![]()
第二部分QPCR筛靶实验 Real-time PCR检测结果显示: HeLa细胞中,相对NC组, 四个靶点中,KD2,KD4对目的基因BXXX1的表达的敲减效率达到80%以上,KD3对目的基因BXXX1的表达的敲减效率也达到50%以上,都是有效靶点。
第三部分Western blot内源验证实验报告 Western Blot检测结果 样品说明: M 为Marker; 1 CON为正常目的空细胞(HeLa)样品; 2 NC为正常目的细胞(HeLa),加阴性对照病毒感染的细胞样品(Negative Control); 3 KD为正常目的细胞(HeLa),加RNAi靶点病毒感染的细胞样品(Knock Down) 从Western Blot结果可以看出,KD1,KD2靶点对HeLa细胞BXXX1的表达有敲减效果,为有效靶点。 第四部分:干扰慢病毒KD1.、对照慢病毒CMV-GFP-L.V.感染HeLa细胞株后筛选稳定株。 HeLa 白光组 White light 荧光组 Fluoresce 稀释度 Day 3, 100× Blank![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]()
三、实验总结: 1、HeLa细胞感染KD1.慢病毒,MOI 10、MOI 20时毒性大,死细胞多。若只计活细胞,感染效率高,都超过80%。 2、HeLa细胞感染CMV-GFP-L.V.慢病毒,MOI 10、MOI 20时感染效率高,都超过90%。 3、传代培养后,最终筛选出HeLa- KD1 MOI 10稳定株,HeLa- KD1 MOI 20稳定株、HeLa- CMV-GFP MOI 20稳定株。 编辑: 陈 版权声明本网站所有注明“来源:丁香园”的文字、图片和音视频资料,版权均属于丁香园所有,非经授权,任何媒体、网站或个人不得转载,授权转载时须注明“来源:丁香园”。本网所有转载文章系出于传递更多信息之目的,且明确注明来源和作者,不希望被转载的媒体或个人可与我们联系,我们将立即进行删除处理。同时转载内容不代表本站立场。 |
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