一种枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法及转化方法

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法及转化方法。

背景技术：

2.枯草芽孢杆菌是一种重要的工业微生物，其遗传学和生理学已被深入研究。枯草芽孢杆菌能直接将目的基因产物分泌到培养基中，且表达产物可溶、可正确折叠并具有生物活性，同时表达产物与胞内蛋白分离，无需破碎细胞，有利于分离和纯化，是应用极为广泛的基因工程表达宿主。3.转化是指细菌摄取外界环境中dna的过程。枯草芽孢杆菌转化机制研究表明，细胞感受外界信号后经过一系列调控途径诱导感受态形成因子comk的产生，comk再调控一系列后期感受态形成基因的表达，这些基因编码细胞膜上识别并接受外源dna的复合体和胞内保护酶等产物，而所有转化的发生都需要细胞处于感受状态，才有可能转化成功。因此，制备性能良好的感受态细胞是实现枯草芽孢杆菌转化的关键步骤。4.然而，枯草芽孢杆菌的转化效率远远低于大肠杆菌等宿主，这限制了其在蛋白质工程以及代谢改造中的应用。在枯草芽孢杆菌工程菌的构建过程中，能够自发形成感受态的菌株极少，而且感受态持续时间短暂，分子克隆效率低。5.感受态效率受到信号转导网络严密的调控。感受态转录因子comk在其中扮演着重要的作用。comk的表达受到abrb、rok(ykuw)、cody等转录因子的抑制，同时也受到edqsu双组分调控系统及comk本身的正向调控。因此，提高枯草芽孢杆菌的感受态效率，可以从两个方面入手，一是敲除comk基因的抑制因子，二是过表达comk正向调控因子。目前有研究证明这两种方式均可行，通过失活rok的编码基因rok，可以使枯草芽孢杆菌bd630的转化效率提高5倍；通过将含有木糖启动子pxyla的comk基因导入枯草芽孢杆菌1a751，得到的枯草芽孢杆菌1a976对dna的转化效率可以提高1000倍。除此之外，xinzhi li等(preparation and transformation optimization for supercompetent b.subtilis sck6 cells)通过改变培养基、诱导剂浓度、质粒类型等参数优化感受态制备的条件。具体地，用yn培养基替代常规lb培养基制备感受态，转化效率提高4倍左右；加入1.5％的木糖诱导2h，感受态的转化效率又提高2倍左右；用大肠杆菌gm272来源的质粒pdg1730使转化效率进一步提高3倍左右，达到106cfu/μg，相对于未优化前提高了2个数量级。6.专利cn201911243090.6公开了一种促进枯草芽孢杆菌自然生长转化的培养基组合及其转化方法，通过优化培养基实现枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备，具体地，将枯草芽孢杆菌接种于lb培养基中振荡培养，随后将培养产物接种于优化后的第一培养基中震荡培养，待od值达到特定值后与无菌的甘油混合，并低温冷冻，随后将产物融化，接种于优化后的第二培养基中培养，得到感受态细胞以进行自然转化。专利cn201910943271.3公开了一种枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化方法，转化过程包括将枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌zk、db104或wb600)接种至lb培养基中过夜，再接种于gm培养基中培养，加入细胞壁弱化剂(由甘氨酸、丝氨酸和二硫苏糖醇组成)继续培养至od值达到0.9，收集枯草芽孢杆菌，将其与质粒pht01或pht304混匀并进行电击，电击转化后热激，实现转化。专利cn201610297900.6公开了一种高转化率的枯草芽孢杆菌，其以枯草芽孢杆菌a164为宿主，将其中的中性蛋白酶基因npre敲除，并替换为xylr-pxyla-comk表达单元。7.异养型枯草芽孢杆菌3na(bacillus subtilis 3na)是由michel和mille分离得到的spo0a突变株，并由reuβ及其同事于2015年鉴定为枯草芽孢杆菌168及其亚种w23菌株的杂交种。该菌为非产芽孢菌株，在cdm中表现出较高的生长速率，是唯一一种在补料分批发酵过程中允许高细胞密度培养的芽孢杆菌菌株(细胞干重[cdw]高达75g/l)。这种独特的表型使枯草芽孢杆菌3na菌株成为一种极好的生产生物分子的候选菌株。然而，有研究指出，枯草芽孢杆菌3na被定性为不可转化菌株，其实际转化效率较低，与枯草芽孢杆菌168相当。这在很大程度上限制了枯草芽孢杆菌3na的进一步开发应用。[0008]目前关于如何提高枯草芽孢杆菌转化效率的研究非常之多，然而，在枯草芽孢杆菌3na中dna突变文库的克隆和转化并不像在大肠杆菌中那样容易操作且高效。目前较多使用的转化方法(两步法或高渗透压电穿孔法)皆耗时费力，操作繁琐，效率低下。因此，在枯草芽孢杆菌3na中开发省力且转化效率足够高的转化方法十分重要。

技术实现要素：

[0009]为解决上述技术问题，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法及转化方法，以枯草芽孢杆菌为宿主，通过使用木糖诱导型启动子pxyla在基因组上过表达一个额外拷贝的comk基因获得一株转化效率提高的重组枯草芽孢杆菌，并进一步制备成感受态细胞，再通过对培养基种类、种子液培养时间、外源dna添加用量、感受态中甘油添加量的优化，建立了一种高效、便捷的dna转化方法，对枯草芽孢杆菌表达系统的应用和提高其生产性能具有重要意义。[0010]本发明的第一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法，包括以下步骤：[0011]s1、将转录因子comk基因转入枯草芽孢杆菌中，得到重组枯草芽孢杆菌，所述转录因子comk基因由木糖诱导型启动子pxyla调控表达；[0012]s2、将s1中重组枯草芽孢杆菌活化，并接种于第一培养基中进行培养，获得种子液，将种子液接种于第二培养基中进行培养，加入木糖继续培养，诱导形成所述枯草芽孢杆菌感受态细胞；[0013]其中，所述第一培养基和第二培养基同时为以下(1)-(2)中的一种：[0014](1)培养基的组成为：蛋白胨15-25g/l，酵母粉1-10g/l，牛肉膏1-10g/l，nacl 10-20g/l，kh2po4 10-20g/l，k2hpo4 1-10g/l；[0015](2)培养基的组成为：蛋白胨10-15g/l，酵母提取物20-30g/l，甘油1-10g/l，k2hpo4 1-5g/l，kh2po4 10-15g/l。[0016]进一步地，所述转录因子comk基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。[0017]进一步地，所述木糖诱导型启动子pxyla的核苷酸序列如seq id no.2所示。[0018]进一步地，在步骤s1中，所述转录因子comk基因经同源重组整合至枯草芽孢杆菌基因组上以构建重组枯草芽孢杆菌。[0019]进一步地，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌3na(bacillus subtilis3na)或枯草芽孢杆菌168为宿主。[0020]进一步地，在步骤s2中，所述的活化为将s1中的重组枯草芽孢杆菌接种于lb培养基上，于35-40℃进行培养。其中，lb培养基的组成为：酵母提取物1-10g/l，蛋白胨5-15g/l，nacl 5-15g/l。[0021]进一步地，在步骤s2中，将活化后的重组枯草芽孢杆菌接种于第一培养基中培养2-8h。[0022]本发明的第二个目的是提供一种枯草芽孢杆菌的转化方法，包括以下步骤：将上述重组枯草芽孢杆菌感受态细胞与待转化质粒混合，于35-40℃培养，得到导入所述待转化质粒的重组枯草芽孢杆菌。[0023]进一步地，所述感受态细胞与待转化质粒的用量比为：45-360ng待转化质粒每100μl感受态细胞。[0024]进一步地，所述感受态细胞的制备过程中不添加甘油。[0025]进一步地，所述待转化质粒以pp43nmk为表达载体表达外源dna。[0026]借由上述方案，本发明至少具有以下优点：[0027]本发明以枯草芽孢杆菌作为宿主菌株，通过在其基因组上过表达一个额外拷贝的由木糖诱导型启动子pxyla控制的comk基因，并对其感受态制备所用培养基种类、种子液培养时间、外源dna添加量、感受态中甘油添加量进行了一系列的优化，使重组枯草芽孢杆菌3na的转化效率提高到1.4×104cfu/μg dna，约为初始菌株转化效率的26倍；使重组枯草芽孢杆菌168的转化效率提高到6.72×106cfu/μg dna，约为初始菌株转化效率的726倍。这在一定程度上解除了枯草芽孢杆菌克隆和转化的限制，为其获得更广泛的应用奠定了基础。[0028]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例说明如后。具体实施方式[0029]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。[0030]下述实施例中所涉及的材料与方法如下：[0031]pab培养基(g/l)：蛋白胨20，酵母粉6，牛肉膏6，nacl 14，kh2po414.8，k2hpo4 5.2。定容后ph调至6.5，115℃高压蒸汽灭菌20min。[0032]lb培养基(g/l):酵母提取物5，蛋白胨10，nacl 10，115℃高压蒸汽灭菌20min。[0033]yn培养基(g/l):酵母提取物7，营养肉汤18。[0034]tb培养基(g/l):蛋白胨12，酵母提取物24，甘油5.04，k2hpo4 2.31，kh2po4 13.28，115℃高压蒸汽灭菌20min。[0035]dm3g培养基(g/l):丁二酸钠81，酪氨酸水解物5，ye 5，k2hpo43.5，kh2po4 1.5，mgcl2·6h2o 4，115℃高压蒸汽灭菌20min。[0036]bf培养基(g/l):酵母提取物15，蛋白胨7.5，(nh4)2so4 7.5，[0037]k2hpo4·3h2o 15，kh2po4 31.25，115℃高压蒸汽灭菌20min。[0038]实施例1重组枯草芽孢杆菌3nac的构建[0039]重组枯草芽孢杆菌3nac是以枯草芽孢杆菌3na为宿主，在基因组上整合表达构建成功的以木糖诱导型启动子pxyla控制表达、以链霉素抗性基因为筛选标记的comk基因融合表达框获得。其中，comk基因序列如seq id no.1所示，木糖诱导型启动子pxyla的核苷酸序列如seq id no.2所示。具体如下：[0040]comk基因的序列为：[0041]atgagtcagaaaacagacgcacctttagaatcgtatgaagtgaacggcgcaacaattgccgtgctgccagaagaaatagacggcaaaatctgttccaaaattattgaaaaagattgcgtgttttatgtaaacatgaagccgctgcaaattgtcgacagaagctgccgattttttggatcaagctatgcgggaagaaaagcaggaacttatgaagtgacaaaaatttcacacaagccgccgatcatggtggacccttcgaaccaaatctttttattccctacactttcttcgacaagaccccaatgcggctggatttcccatgtgcatgtaaaagaattcaaagcgactgaattcgacgatacggaagtgacgttttccaatgggaaaacgatggagctgccgatctcttataattcgttcgagaaccaggtataccgaacagcgtggctcagaaccaaattccaagacagaatcgaccaccgcgtgccgaaaagacaggaatttatgctgtacccgaaagaagagcggacgaagatgatttatgattttattttgcgtgagctcggggaacggtattag[0042]启动子pxyla的序列为：[0043]tttttttactaaagcttgatctgcaatttgaataataaccactcctttgtttatccaccgaactaagttggtgttttttgaagcttgaattagatatttaaaagtatcatatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattgaaataaacatttattttgtatatgatgagataaagttagtttattggataaacaaactaactcaattaagatagttgatggataaacttgttcacttaaatcaaagggggaaatgacaaatggtccaaactagtgatatctaaaaatcaaagggggaaatgttaaaggaggaaggatcc[0044]实施例2不同培养基对重组枯草芽孢杆菌3nac进行转化[0045]感受态细胞的制备：将于-80℃保藏的上述实施例1制备的重组枯草芽孢杆菌3nac接种于lb培养基平板上，于37℃培养12h。分别挑取单菌落到每孔装有1ml lb培养基、pab培养基、yn培养基、tb培养基、dm3g培养基或bf培养基的24孔板中，37℃、220rpm培养8h获得种子液，将种子液以20％的接种量对应接种到新的与种子培养时相对应的培养基中(即lb培养基、pab培养基、yn培养基、tb培养基、dm3g培养基或bf培养基)，并以6％的比例向种子液中加入50g/l的木糖，于37℃、220rpm条件下培养2h，诱导形成感受态细胞。向其中以20％的比例加入50％(v/v)的甘油，混匀后待用。[0046]转化：取100μl感受态细胞至已加入90ng质粒(此处转化测试用质粒为pp43nmk-gfp)的1.5ml ep管中，混匀，于37℃、220rpm条件下培养1.5h，涂布平板。[0047]6种不同种类的培养基对枯草芽孢杆菌3nac转化效率的影响效果见表1。使用pab培养基获得的转化效率最高，为3483cfu/μg dna，为相同条件下使用tb培养基获得的转化效率的1.7倍，使用lb培养基获得的转化效率的6.5倍，使用yn培养基获得的转化效率的34.83倍，使用dm3g和bf培养基获得的转化效率的208.6倍。[0048]表1六种不同种类的培养基对枯草芽孢杆菌3nac转化效率的影响[0049][0050]实施例3种子液培养不同时间对重组枯草芽孢杆菌3nac进行转化[0051]感受态细胞的制备：将于-80℃保藏的上述实施例1制备的重组枯草芽孢杆菌3nac接种于lb培养基平板上，于37℃培养12h。分别挑取单菌落到每孔装有1ml pab培养基的24孔板中，37℃、220rpm分别培养2、4、6、8、10、12、14、16h获得种子液，将2h获得的种子液以50％或100％接种量，4、6、8、10、12、14、16h获得的种子液以20％的接种量对应接种到新的pab培养基中，并以6％的比例向种子液中加入50g/l的木糖，于37℃、220rpm条件下培养2h，诱导形成感受态细胞。向其中以20％的比例加入50％(v/v)的甘油，混匀后待用。[0052]转化：取100μl感受态细胞至已加入90ng质粒(pp43nmk-gfp)的1.5ml ep管中，混匀，于37℃、220rpm条件下培养1.5h，涂布平板。[0053]种子液不同培养时间对枯草芽孢杆菌3nac转化效率的影响见表2，可见，2-8h种子液最终所获得转化效率相当，为1.1×106cfu/μg dna。[0054]表2种子液不同培养时间对枯草芽孢杆菌3nac转化效率的影响[0055][0056]实施例4使用不同添加量的质粒对重组枯草芽孢杆菌3nac进行转化[0057]感受态细胞的制备：将于-80℃保藏的上述实施例1制备的重组枯草芽孢杆菌3nac接种于lb培养基平板上，于37℃培养12h。分别挑取单菌落到每孔装有1ml pab培养基的24孔板中，37℃、220rpm培养8h获得种子液，将种子液以20％的接种量对应接种到新的pab培养基中，并以6％的比例向种子液中加入50g/l的木糖，于37℃、220rpm条件下培养2h，诱导形成感受态细胞。向其中以20％的比例加入50％(v/v)的甘油，混匀后待用。[0058]转化：取100μl感受态细胞至已加入9、18、27、36、45、135、270、360ng质粒(pp43nmk-gfp)的1.5ml ep管中，混匀，于37℃、220rpm条件下培养1.5h，涂布平板。[0059]外源dna不同添加量所获得的枯草芽孢杆菌3nac转化子的数量见表3。综合转化效率与最终获得的转化子数量两方面考虑，以每100μl感受态混合135ng外源质粒dna进行转化为最优。[0060]表3外源dna不同添加量对枯草芽孢杆菌3nac转化子数量的影响[0061][0062]实施例5感受态细胞中不添加甘油对重组枯草芽孢杆菌3nac进行转化[0063]感受态细胞的制备：将于-80℃保藏的上述实施例1制备的重组枯草芽孢杆菌3nac接种于lb培养基平板上，于37℃培养12h。分别挑取单菌落到每孔装有1ml pab培养基的24孔板中，37℃、220rpm培养10h获得种子液，将种子液以20％的接种量对应接种到新的pab培养基中，并以6％的比例向种子液中加入50g/l的木糖，于37℃、220rpm条件下培养2h，诱导形成感受态细胞。[0064]转化：取100μl感受态细胞(感受态细胞中未混有甘油)至已加入90ng质粒(pp43nmk-gfp)的1.5ml ep管中，混匀，于37℃、220rpm条件下培养1.5h，涂布平板。发现感受态细胞中不添加甘油获得的转化效率最高，为1.4×104cfu/μg dna，是添加甘油时转化效率(2927.8cfu/μg dna)的4.8倍。[0065]实施例6使用相同方法测试在枯草芽孢杆菌168中转化效率[0066]首先，采用相同方法构建重组枯草芽孢杆菌bsxc，其以枯草芽孢杆菌168菌株为宿主，在基因组上整合表达构建成功的以木糖诱导型启动子pxyla控制表达、以链霉素抗性基因为筛选标记的comk基因融合表达框获得。其中，comk基因序列如seq id no.1所示，木糖诱导型启动子pxyla的核苷酸序列如seq id no.2所示。[0067]然后，采用相同方法进行感受态细胞的制备，即：将于-80℃保藏的重组枯草芽孢杆菌bscx接种于lb培养基平板上，于37℃培养12h。分别挑取单菌落到每孔装有1ml lb培养基或pab培养基的24孔板中，37℃、220rpm培养8h获得种子液，将种子液以20％的接种量对应接种到新的与种子培养时相对应的培养基中，并以6％的比例向种子液中加入50g/l的木糖，于37℃、220rpm条件下培养2h，诱导形成感受态细胞。[0068]最后进行转化效率测试：取100μl感受态细胞至已加入90ng质粒(此处转化测试用质粒为pp43nmk-gfp)的1.5ml ep管中，混匀，于37℃、220rpm条件下培养1.5h，涂布平板。[0069]结果表明，使用pab培养基获得的转化效率为6.72×106cfu/μg dna，使用lb培养基获得的转化效率为9.26×103cfu/μg dna。新方法为相同条件下使用传统方法lb培养基获得的转化效率的726倍，证明本发明方法对于其他枯草芽孢杆菌菌株的普适性。[0070]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。