羟胺氧化还原酶在生物脱氮中的研究进展

含氮化合物在生命代谢过程中扮演着重要的角色，参与生物地球化学循环[1]。近年来，为了满足人类的生产生活需求，农田氮肥的大量施用、工业废水的随意排放、养殖场的扩建、垃圾场废水的渗漏等，导致水体受到不同程度的含氮物质污染。据报道，国内已有75%以上的地表水受到氮污染，铵态氮是饮用水和地下水超标的主要物质之一[2-6]。水是生命之源，过量的氮元素不仅会使水体恶化、释放难闻气味，而且对人类健康和水生生物的生存也有着巨大的威胁[7]，因此去除水体中氮污染物质显得尤为重要。

生物脱氮是一种高效、绿色环保和经济节约型的废水治理技术。脱氮微生物的发现已有100多年的历史，传统的生物脱氮技术通常依赖于微生物的自养硝化和厌氧反硝化过程[8]，随着新的生物脱氮菌株不断被发现，微生物的氮转化过程也在不断被丰富。目前已报道的生物脱氮菌株多数为细菌，少量为古细菌或真菌。然而需要注意的是，许多微生物硝化反应脱氮过程往往会产生并积累氮代谢中间产物如羟胺，这是一种会对微生物产生毒害作用的脱氮中间产物或次生代谢产物，会降低脱氮菌的生物活性和脱氮速率，甚至引起脱氮系统崩溃[9]，因此，快速去除脱氮系统中积累的羟胺有利于提高生物脱氮效率。此外，近期研究发现，羟胺与生物脱氮过程中产生的强烈温室效应气体N2O密切相关，而且已证实羟胺是N2O排放的促进剂，该过程受HAO的调控[10-11]。HAO作为生物脱氮过程的关键酶之一，研究者们主要从参与氮代谢相关的不同种类微生物中分离纯化相应的酶蛋白、解析其蛋白结构和酶反应动力学等方面研究HAO。长期以来，HAO一直被认为是羟胺直接转化为亚硝酸盐的催化剂，然而最近的酶学证据表明，HAO的催化产物还有NO和N2O[12-13]，因此，HAO参与的生物脱氮过程在不同脱氮菌中可能存在差异。重新认识HAO参与的氮循环过程有助于提高生物脱氮效率与控制温室气体排放，对开发新型生物脱氮工艺具有重要的指导意义。本课题组前期分离获得了多株能高效转化羟胺并利用其进行生长的生物脱氮菌，同时致力于该类菌转化羟胺的途径研究，但对于HAO在生物脱氮过程中的作用机理仍缺乏全面系统的认识。

本文结合国内外对HAO的研究报道，系统分析了HAO在脱氮微生物的分布情况、蛋白结构、编码基因、催化氮转化的机理以及影响其酶活的相关因素，并对今后的研究方向及应用提出展望，以期为微生物脱氮机理研究和降低温室气体释放的氮污染废水治理工艺应用研究提供参考。

HAO属于八重体蛋白家族，是微生物硝化过程中的关键酶，存在于细胞膜外周质中，含有多种c型血红素和一个P460发色团，是最复杂的血红素蛋白之一[14]。目前，通过BLASTp可以搜索到来自各种微生物的数百种血红素蛋白，这些蛋白与HAO同源，结合HAO酶活性相关研究报道，已证实HAO存在于粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)[15]、芽孢杆菌(Bacillus sp.)[16]、不动杆菌(Acinetobacter sp.)[17-18]、假单胞菌(Pseudomonas sp.)[11, 19-20]、善变副球菌(Paracoccus versutus)[21]、谷氨酸杆菌(Glutamicibacter arilaitensis)[22]、梅久兰链霉菌(Streptomyces mediolani)[23]、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)[24]、厌氧氨氧化菌[25]和硝化螺旋菌(Nitrospira sp.)[26]等氨氧化细菌中。也有研究者认为[26]，HAO是所有氨氧化细菌均能编码的一种酶，与之对应的氨氧化古菌则因为缺乏编码HAO相应的同源序列而被认为不存在HAO，但部分参与羟胺氧化还原的酶在古菌中仍有报道[27]，因此，氨氧化古菌能否合成HAO仍有待商榷。此外，据推测许多甲烷氧化菌在生物参与的氮循环中也有着重要作用，因为其基因组中也存在编码羟胺氧化还原酶(mHAO)的基因序列，但目前仍缺乏相关的生化证据[28]。

不同微生物对碳源和氮源的利用及代谢途径存在着很大差异，HAO在不同微生物中的合成量及酶活性也各不相同，在未经纯化的情况下，某些微生物胞内是否转录合成HAO在检测时可能会受到其他酶的干扰，因此，仅仅依靠蛋白序列分析或生理生化过程判断并不能准确反映HAO是否存在，必要时还可结合其他方式方法进行多重验证，如分子生物学方法。

HAO和大多数酶一样，是一类在活细胞中产生的具有催化作用的蛋白质，其功能主要由其结构所决定，其合成受编码的基因所调控，了解HAO的结构和调控基因序列有助于明晰其活性易受哪些因素影响，深入理解其在生物脱氮中的作用机理。

自养硝化菌是一类革兰氏阴性的化能自养菌，能够氧化某种无机物并利用其所产生的化学能还原二氧化碳，生成有机碳化合物。自养硝化细菌的氨单加氧酶可将铵盐氧化为羟胺，在该氧化过程所产生的能量条件下，HAO进一步催化羟胺转变成亚硝酸盐，进而完成亚硝化作用[29-30]。生物化学基础理论普遍认为蛋白酶的氨基酸序列决定其结构，进而实现相应的生物学功能。纯化的HAO结构研究表明[31-32](图 1)，自养硝化细菌的HAO是一种复杂结构排列的同源三聚体蛋白，其三级结构和四级结构采用了均三聚构型或其倍数，包含3个亚基，每个亚基大小为63 kDa，含有8个共价结合的血红素，其中7个由双His连接的c型电子转移血红素组成，是配位饱和的，另外一个由His轴向连接的5配位催化血红素组成，称为P460辅因子，其为HAO催化的关键位点，可能会被21个非P460的血红素辅助因子掩盖。相关研究表明[33-34]，自养硝化菌和甲烷氧化菌的HAO至少含有一种P460辅因子和几种c型血红素。血红素P460辅因子结构极其复杂，由一个非常褶皱的c型血红蛋白组成，从与血红素铁结合的配体中提取电子，而其他参与氧化还原化学反应的血红素通常将电子注入其配体中[35]。此外，P460辅因子血红蛋白卟啉和保守的酪氨酸之间还存在2个共价键[36](图 2)，也许正是酪氨酸交联和血红素皱折这一特殊结构赋予了P460辅因子异常的吸电子活性，导致其偏离了典型的血红素氧化还原化学反应[37]。深入研究血红素P460辅因子的结构有助于理解其在生化反应中的作用机理，揭示非常规血红素蛋白交联的一些关键功能。

HAO单体之间通过独特的双交联结构相互连接，即酪氨酸的C3和酚的O原子分别连接到相邻亚基催化血红素部分的C5和C4原子上[38]。Klotz等[39-40]认为这种交联结构有利于HAO催化氧化反应，而无这种交联结构则被预测有利于催化还原反应。这一假说在Ferousi等[38]的报道中得到证实，他们从依赖亚硝酸盐的厌氧氨氧化细菌中提纯得到了HAO同系物HAOr，HAOr结构中缺乏血红素-酪氨酸交联，可以将亚硝酸盐还原为一氧化氮，同时可还原作为非生理底物的一氧化氮和羟胺，但不能氧化羟胺，表明缺乏交联的HAO酶是还原酶。与氧化型HAOs相比，HAOr具有较高的中点电位(至少80 mV)和较低卟啉褶皱程度[约0.7 (A°)−1.2 (A°)]的活性位点血红素[41]。

HAO的转录是通过NH4+的添加诱导完成的，编码HAO的基因簇包括重复hao基因、cycA基因(编码细胞色素c554)和cycB基因(编码四血红素细胞色素c552)；hao基因位于cycA基因上游1 162 bp处，但这2个基因通常分布在不同的操纵子上；cycB基因位于cycA基因下游，其下游还有单拷贝基因cyp (编码细胞色素P460)、cyt (编码细胞色素c552)、dcp (编码双亚铁血红素c553过氧化物酶)；在欧洲亚硝化单胞菌中，编码HAO的hao基因3个拷贝的编码区具有同一性，其中有1个拷贝存在核苷酸差异，转录分析表明hao基因的重复拷贝hao1和hao2的核苷酸序列在上游区160 bp内几乎完全相同，其起始密码子上游71 bp的转录起始位点为σ70启动子序列，而hao3拷贝的σ70启动子序列则位于起始密码子上游54 bp处[42-43]。此外，hao3拷贝与cycA基因紧密地连在一起，而且该基因还能够编码一个18–24氨基酸前导肽序列，引导HAO蛋白在胞内转运、折叠和修饰等过程[30]。

异养硝化菌可利用有机碳进行生长，具有生长快、耐受性强等优点，并且已被证明具有强大的脱氮潜能，近年来已经成为生物脱氮的研究热点[44]。目前异养硝化菌的硝化作用机理仍在不断探索之中，国内外对于异养硝化作用的研究大多集中在异养硝化菌的分离鉴定及对氨氮的去除效率方面，从酶学与基因组学角度对异养硝化作用进行研究的报道较少。异养硝化菌的HAO在氧化1分子羟胺的过程中产生2个电子，这2个电子用于还原亚硝酸盐，该过程用于驱除细胞内多余的还原力，并不产生能量，同时也偶联了硝化和反硝化过程；而自养硝化菌在氧化1分子羟胺的过程中可产生4个电子，其中2个电子用于还原辅酶Q，另外2个电子还原细胞色素c，以生成ATP和NADH[42]。相较于自养硝化菌，异养硝化菌的HAO结构较简单，大多是不含血红素的单体周质蛋白，如从异养硝化菌Thiosphaera pantotroph和Pseudomonas sp.获得的HAO分别是20 kDa和19 kDa左右的单体蛋白[45-46]。异养硝化菌的HAO酶活性中心与自养硝化菌也有所不同，自养硝化菌的HAO以血红素P460为酶活性中心，而以非血红素铁为活性中心的HAO可能在异养硝化细菌中广泛分布，如脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)的HAO显示该类酶每个分子含有3–5个铁离子，酶的羟胺氧化活性可明显被Fe2+或Fe3+激活而被EDTA抑制，说明该类酶含有易变铁离子且其对维持酶活是必需的[42]；异养硝化菌A. faecalis IFO1311的HAO酶活性在加入铁离子后也显著提高[47]。然而，Wehrfitz等[45]发现异养硝化菌Thiosphaera pantotropha的HAO不含有任何血红素辅基；Jetten等[48]在假单胞菌(Pseudomonas sp.) PB16的HAO中也发现了类似的情况，作为异养硝化菌硝化过程的关键酶之一，HAO的提取纯化及其酶结构功能的解析鲜有报道，因此，铁是否为异养硝化菌HAO活性中心所必需的元素仍有待更多的实验证明。从现有的研究来看，自养硝化菌和异养硝化菌编码HAO的hao基因序列相似性较低，甚至不同异养硝化菌株之间的hao基因也存在较大的差异。此外，尽管异养硝化的无机氮代谢途径与自养硝化菌存在相似之处，但由于缺乏足够的证据，异养硝化菌的HAO基因表达及调控是否与自养硝化菌存在显著差异还不明确，有关HAO在异养硝化过程中的作用机理仍有待进一步探索。

生物脱氮指的是在污水处理的过程中，含氮化合物在脱氮微生物的联合作用下通过氨化、厌氧氨氧化、硝化及反硝化等反应在有氧或厌氧条件下将污水中的含氮污染物最终转化为气态氮的过程，从而达到废水脱氮的目的。目前已分离到的HAO具有多种催化功能，可以氧化肼(N2H4)和羟胺，还原亚硝酸盐、一氧化氮和羟胺。传统的生物脱氮理论普遍认为HAO是催化羟胺转化成亚硝酸盐的生物脱氮酶，位于膜外周质中，但是随着脱氮微生物种类的不断丰富，HAO催化羟胺转化的产物也有了新的发现。近期研究结果发现，HAO与硝化过程中NO及N2O的产生也有关联。

微生物脱氮过程中，羟胺是已知的脱氮中间产物。长期以来，人们一直认为在合适的电子受体存在情况下，HAO可以将羟胺氧化为亚硝酸盐，但羟胺转化为亚硝酸盐的具体催化步骤仍存在争议。早期，Yamanaka等[49]发现无论在好氧或厌氧条件下，HAO催化羟胺生成亚硝酸盐的产率取决于所加入的电子受体与羟胺的比例及反应所使用的缓冲液种类；如在反应体系中加入足够数量的细胞色素c或铁氰化物，HAO几乎将羟胺完全氧化为亚硝酸盐，而且亚硝酸盐的生成量与电子受体的加入量呈正相关；在有氧条件下，氨氧化反应通过膜结合的氨单加氧酶(ammonia monooxygenase，AMO) 催化铵氧化为羟胺(NH4+→NH2OH)，然后再由HAO将羟胺氧化为亚硝酸盐(NH2OH→NO2−)，此过程主要由氨氧化细菌(ammonia-oxdizing bacteria，AOB)介导完成。目前公认的AOB代谢模型(主要基于对Nitrosomonas europaea AOB模型的研究)通过下面两步酶促反应进行[50]：

HAO是目前已知的唯一能在循环过程中从血红素连接底物中回收电子的酶。如图 3所示，氨氧化代谢模型第一步反应由AMO催化依赖氧气的氨羟基化生成羟胺，此过程需要2个电子的参与；随后，羟胺通过HAO催化失去4个电子被氧化成亚硝酸盐，4个电子转移到HAO的生理电子受体——CytC554，其中2个电子返回到AMO参与第一步的催化反应，另外2个电子进入细胞膜上呼吸电子传递链的末端氧化酶，以O2作为末端电子受体促成电化学梯度，驱动胞内物质和能量进行转换，维持细胞活性[51-52]。

NO在细胞间通讯、微生物防御和氮循环过程中均具有重要作用，是生物脱氮过程中多种无机氮化合物还原和氧化的中间体之一。有酶学研究表明，HAO氧化羟胺的不完全或O2浓度不足时其产物为NO[12, 28, 53]。此外，NO作为HAO的催化产物很难被直接检测到，是研究所面临的重大障碍，其主要原因有以下两点：(1) O2存在的情况下，NO的寿命很短。在空气饱和条件下，当NO浓度为10–100 µmol/L时，NO的半衰期为5.6−56.0 s，还会发生二级反应生成亚硝酸盐；(2) 无氧或厌氧条件下，NO仍然很难被检测到，这是因为NO可以在酶的催化作用下被转化为NH4+、亚硝酸盐、硝酸盐和N2O[32, 54]。Caranto等[12]为了证明NO是N. europaea的HAO催化羟胺的专有产物，使用了由Pacheco等[55]开发的NO封存系统，在该系统中，NO清除剂过氧化氢酶在403 nm处呈现Soret带，在500 nm和700 nm处呈现低分辨率的吸光度特征，而在迅速结合NO之后，出现明确的紫外-可见(UV-vis)吸收特征，即Soret带移至433 nm处，同时在542 nm和579 nm处出现2个分辨率清晰的谱带，通过NO与过氧化氢酶结合后在433 nm处引起的吸收变化可对NO进行量化。实验结果表明，无论在有氧还是无氧的条件下，N. europaea菌的HAO氧化羟胺产物都是NO而不是亚硝酸盐，这意味着AOB需要3个步骤才可能将NH3氧化成亚硝酸盐，同时也表明NH3氧化途径还需要第3种未知的酶才能将NO转化为亚硝酸盐。最近一项蛋白质组比较研究显示[27]，亚硝基蓝蛋白(nitrocyanin，NcyA)在3种不同的氨氧化细菌中高度表达，在转录水平上，NcyA的序列与铜型亚硝酸盐还原酶的Ⅰ型铜结合区显著同源，不同的地方在于NcyA存在与His2/Cys/Glu/H2O连接的方锥形铜位点[56]，揭示其可能具备不同的生物学功能，或许在NO氧化为亚硝酸盐的氮代谢途径中发挥重要作用，是NH4+→NH2OH→NO→NO2−途径中尚未揭示的第3种酶；也有研究认为一氧化氮氧化还原酶(nitric oxide oxidoreductase，NOO)负责将NO氧化为亚硝酸盐[57, 12]。因此，第3种酶的确定仍需要更多的实验证据。

生物脱氮的过程中会产生大量的N2O，N2O不仅在平流层、地球辐射平衡和全球氮循环中起着重要的作用，而且具有强烈的增热效应，其升温潜势比CO2大300多倍[11]，过量的N2O释放会破坏人类的生态环境，影响农业、林业及畜牧业等方面的经济发展，是不可忽视的潜在威胁。由于N2O在生物废水处理的温室气体排放总量中占主导地位，N2O的产生途径一直是废水生物脱氮备受关注的问题，目前已有相关研究对其潜在产生途径进行了探索[58]。N2O被认为是好氧反硝化的主要中间产物(NO2−→NO→N2O→N2)，但也有研究结果表明，在生物脱氮的过程中硝化阶段也产生N2O，而且与HAO参与的催化反应相关，与反硝化过程无关[13, 59]。根据15N同位素示踪实验，Otte等[60]认为N2O和N2不是在好氧条件下还原亚硝酸盐所产生，而可能是由粪产碱杆菌A. faecalis TUD的异养硝化作用氧化羟胺所导致，Joo等[61]也报道过类似的现象。在连续培养的Alcaligenes faecalis NR菌株中增加羟胺的投加量，羟胺氧化的直接副产物N2O的产量也会随之增加[62]。以上研究均表明N2O的产生可能与HAO催化羟胺氧化相关，然而N2O与HAO之间的复杂关系尚未得到合理的解释。与之相对应，也有研究者认为羟胺仅仅只是N2O产生的促进剂，但其背后的作用机理同样尚未阐明[10, 63]。

截至目前，由于确切的证据不足，硝化菌生物脱氮过程中产生N2O的作用机理还不清楚，研究者们对其进行了多方面的推测和验证。有研究者认为，N2O的产生仅仅是由于羟胺和氧气(2NH2OH+O2→N2O+3H2O)或亚硝酸盐(NH2OH+ NO2−+H+→N2O+2H2O)之间的非化学反应[58, 64]，而Caranto等[12]在厌氧条件下研究HAO作用机理时通过对Cyt P460的活性位点进行改造，发现Cyt P460催化铁结合的羟胺氧化成亚硝基铁{FeNO}6，当第2个羟胺分子继续对{FeNO}6进行亲核攻击时也会导致N2O的生成；此外，根据对自养硝化菌N. europaea的研究，NO可能是HAO催化羟胺氧化的唯一产物，由此推测自养硝化菌产生的N2O还可能源于NO的还原[12, 65-66]，或更有可能是硝化菌在HAO催化下氧化羟胺生成[67-68]。目前比较被人们接受的是Moir等[24]提出的一个假设，即通过HAO的Fe3+-Fe3+中心位点催化羟胺形成不稳定的中间产物HNO，对于HNO的进一步氧化，可能涉及(2)和(3)这2个反应：

综上所述，可以发现HAO在生物脱氮中可能具有多种催化作用，参与羟胺、亚硝酸盐、NO、N2O等氮化合物的代谢过程，但许多代谢过程背后的机理仍缺乏充足的实验证据加以明确。根据前人研究将HAO在生物脱氮中的作用机理总结为图 4中可能存在的模型，以期为后续研究提供参考。

酶通常是在生物体内合成，具有催化生物化学反应并传递电子、原子和化学基团的生物学功能。微生物的生长和代谢需要在酶的作用下才能顺利进行。大量研究表明，由于生存环境和代谢方式的差异，从不同细菌内纯化出来的HAO其酶活也各不相同，如表 1所示。这些微生物的酶活力会受环境因子如培养温度、pH、金属离子、硝化抑制剂和电子受体等方面的影响。

温度作为一个强环境因素，不仅会影响脱氮微生物的生长速率，同时也会通过影响氮代谢相关酶的活性对脱氮菌的脱氮性能产生显著影响。通常情况下，酶只有在特定的温度范围内才能发生作用，一旦超出这个温度范围，酶活性会降低甚至完全失活，通常高温会造成酶结构的改变而导致永久性失活，低温则会抑制酶的活性。HAO对温度的需求与脱氮微生物的生存环境相关，多数脱氮细菌HAO的最适温度为30 ℃[16, 18, 25, 62]。有报道表明，部分HAO对较高温度也具有耐受性，如Shimamura等[25]为了测试氨氧化细菌KSU-1菌株HAO的热稳定性，将提取的粗酶液置于不同温度的100 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液中放置2 min，发现该酶在60 ℃以下时保持了初始活性的90%以上，而且在温度高达65 ℃时表现出最大的酶活性。与之相对应的是少数脱氮菌的HAO在低温条件下仍能表现出酶活性，如本课题组前期分离获得的耐冷脱氮菌Pseudomonas taiwanensis J488[11]，该菌含有的HAO在15 ℃条件下也能高效地将羟胺转化为氮气和生物量氮的能力。此外，还有报道显示，Acinetobacter sp. Y16的HAO在胞外以羟胺为底物，以铁氰化物为电子受体时其酶活最佳温度也为15 ℃且在较宽的温度范围(4−40 ℃)内均能表现出氧化羟胺的能力，而且在4−15 ℃范围内较稳定，酶活力变化小于30%[17]。

pH也是影响酶活性的一个重要因素，pH的高低不仅可以改变酶的构象，还影响活性基团、酶与底物分子的解离状态，从而直接或间接地影响脱氮微生物的生长代谢和脱氮效率。HAO和大多数蛋白酶相似，在强酸或强碱环境下易变性失活，其酶活一般在微碱性或碱性条件(7.5−9.0)下最强[47, 62]。如菌株Bacillus sp. K5与Acinetobacter sp. Y16的HAO酶活性分别在pH 8.0和pH 7.5时达到最高，但pH值低于7.0和6.5或高于9.0时酶活性急剧降低甚至检测不到活性[16-17]。有的细菌以不同物质作为电子受体时HAO最适酶活所对应的pH也有所不同，如异养硝化菌Paracoccus denitrificans GB17的HAO以哺乳动物细胞色素c作为电子受体时，其酶活性在pH值为8.5时达到最大值，高于8.5则活性丧失，而以假蓝蛋白和细胞色素c550为电子受体时pH升高至10.0和11.0仍可检测到该酶的活性[24]。少数脱氮微生物的HAO在较宽的pH范围内也能保持活性稳定，如不动杆菌(Acinetobacter sp.) Y1的HAO在pH 3.0−10.0的条件下均具有活性，在pH 6.0–9.0时活性较强，其中pH 8.0时活性最强[18]。

金属离子广泛地存在于自然界中，其为废水处理过程中的另一个环境压力。微量的金属离子是微生物生长、繁殖及功能表达所必需的营养元素，这是因为一部分金属离子是酶的重要活性部位，并影响着酶的三维结构和构型，但过量的金属离子会对细胞产生毒害作用，扰乱微生物的生命活动及物质代谢过程[69]。HAO是一种含有金属离子的共轭酶，金属离子会对其活性产生很大的影响，进而影响脱氮菌的生长和脱氮速率。不同金属离子对HAO酶活的促进及抑制效果不同，研究金属离子对A. faecalis NR HAO活性的影响时发现，Ca2+的添加提高了HAO的活性，Mn2+的加入明显降低了HAO的活性，表明Mn2+的存在抑制了HAO的活性[62]。即使是同一金属离子对不同硝化菌HAO酶活的抑制和促进效果也存在差异。1 mmol/L的Fe2+和Fe3+可使Acinetobacter sp. Y1的HAO酶活分别提高43.78%和25.64%[18]；Fe2+的加入同样提高了异养硝化菌P. denitrificans GB17和A. faecalis IFO1311的HAO活性[24, 46]，却对A. faecalis TUD的HAO活性未产生显著的影响[60]。金属离子影响HAO酶活性的方式较为复杂，而且目前关于金属离子影响HAO酶活性的具体作用机理的报道仍为空白，但现实废水处理问题中，无论是工业废水还是生活污水均可能含有金属离子，因此其作用机理值得进一步地研究和阐明。

酶抑制剂是指特异性作用于酶的某些基团、降低酶的活性甚至使酶活性完全丧失的物质，不同抑制剂的抑制作用机理存在差异，抑制强度还与抑制剂浓度相关。乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)是一种金属螯合剂，可以清除二价阳离子，使依赖金属离子的酶失活，如果EDTA对酶活性有抑制作用，说明金属离子对该酶活性起关键作用。研究发现[18]，0.4 mmol/L EDTA对Acinetobacter sp. Y1的HAO有促进作用，但随着剂量的增加逐渐产生负效应，表明其HAO活性中心的铁元素应为亚铁离子，低浓度的激活可能是EDTA解除了其他金属阳离子的抑制作用所致。众所周知，苯肼是一种自杀抑制剂，有研究者发现[70]其对不同脱氮菌的HAO活性也表现出不同的抑制效果，当苯肼与Nitrosomonas europaea的HAO (NeHAO)中的P460特异性结合时，10 mmol/L的苯肼即可抑制约60%的NeHAO活性，而在相同浓度下却对Nitrosococcus oceani HAO的(NoHAO)活性几乎无抑制作用，这可能预示着苯肼抑制剂对HAO底物结合位点周围的局部环境也具有选择性。Schalk等[71]发现氰化物、H2O2、十二烷基硫酸钠(SDS)对厌氧氨氧化细菌的HAO活性也具有抑制作用，其中H2O2的抑制效果最强，40 µmol/L H2O2即可使HAO活性降低95%，而且3种化合物的抑制效果均与加入的浓度呈正相关。

大量胞外实验结果[17, 25, 72]证实，不同电子受体的选择对HAO的活性测定会产生不同的影响，因此，为了提高测定HAO活性方法的准确性，在对HAO的酶活进行测定时，通常会在初步测试时使用不同的电子受体。常用的电子受体包括铁氰化钾[K3Fe(CN)6]、细胞色素c、吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate，PMS)、甲基噻唑基四唑溴化铵(methylthiazolyl tetrazolium bromide，MTT)、2, 6-二氯靛酚钠(2, 6-dichloroindophenol sodium salt，DCPIP)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)等。细胞色素c和K3Fe(CN)6是目前已知的大多数HAO的电子受体，使用其中一种作为电子受体即可检测到目的菌株HAO的酶活，如脱氮菌A. faecalis NR[62]和A. calcoaceticus HNR[67]的HAO以细胞色素c为电子受体时均表现出高活性，以K3Fe(CN)6为电子受体时则几乎测不到其活性，这与菌株Acinetobacter sp. Y1[18]和A. faecalis C16[72]的表现刚好相反。有些脱氮菌的HAO对电子受体的选择性不高，如研究厌氧氨氧化细菌KSU1的HAO酶活时，以羟胺为电子供体，在pH 8.0和35 ℃条件下测定了纯化酶的动力学性质，结果显示除NAD+外，细胞色素c、PMS+MTT和K3Fe(CN)6均可作为HAO氧化的电子受体，其中以铁氰化钾作为电子受体时测得的HAO活性最高[25]。此外，胞内研究发现，亚硝化单胞菌HAO的直接电子受体是CytC554，这是一种存在于自养硝化菌中的四血红素c型细胞色素，被认为是在醌池水平上给电子传递链提供电子，在羟胺存在的条件下可以被HAO的2个电子还原[33]；而异养硝化菌Paracoccus denitrificans GB17的HAO电子受体是CytC550[24]。

综上所述，在不同硝化细菌中HAO的生物化学特性存在差异，通过研究生存环境对HAO酶活性的影响，发现生存环境主要通过影响HAO的结构、活性中心及电子传递过程等影响酶的催化效率，因此，温度、pH、金属离子和抑制剂等因素的探索可能在解决生物脱氮硝化过程中羟胺积累和N2O减释问题方面具有积极意义。

HAO作为生物脱氮过程的关键酶，广泛存在于氨氧化、自养硝化和异养硝化微生物中，但其相关研究报道还较少，阐明HAO的作用机理有助于控制羟胺氧化还原的生物化学过程，并加深对生物脱氮菌以铵为能源的初级代谢途径的理解。近年来，随着异养硝化菌的不断报道，对HAO也有了新的认识，本文系统地综述了HAO在不同脱氮微生物的分布情况、蛋白结构、基因表达差异、生物脱氮中的作用机理、酶活性影响因素与电子受体的差异性，有利于更全面地了解HAO及其在生物脱氮过程中的作用机理，但仍有许多问题有待后续研究者解决：

(1) 已有文献报道部分古细菌具有氨氧化作用，但未发现与HAO相似的基因编码序列，因此，古细菌是否产生相似功能的HAO及其对生物脱氮过程的作用机理有待进一步研究。

(2) 异养硝化菌HAO氨基酸序列与自养硝化菌不存在显著同源性，表明编码和调控HAO的基因序列可能也存在较大差异，但目前缺乏对异养硝化菌HAO编码基因表达调控的研究证据。基于该现状，从不同硝化微生物特别是异养硝化菌中分离与纯化HAO，并结合基因组学与转录组学的研究是探索该酶生物多样性的趋势之一。

(3) 部分研究者认为HAO在生物脱氮过程中的作用产物仅有NO，但该论断仅在胞外实验中获得，尚缺乏胞内实验证实，假设该论断在胞内也成立，那么NH2OH→NO→NO2−和NH2OH→ NO→N2O过程是如何进行的、负责将NO氧化为亚硝酸盐的第3种酶又是什么，这些问题也许可通过结合转录组学、蛋白质组学的研究方法与胞内生化代谢过程研究得到解决。

(4) 代谢途径中的关键酶往往决定生化反应速度，所以关键酶的研究对于代谢途径的优化具有重要的作用，而氮循环中羟胺氧化途径所面临的一个主要挑战是缺乏关键酶HAO的生化特征信息。如金属离子和抑制剂可影响HAO的活性，但具体的作用机理仍缺乏较为全面的实验证据，这阻碍了人们对HAO作用机理的深层次认识，突破这一限制将会是这一领域未来研究的工作重点，可以利用动力学、光谱学和理论研究对HAO的作用机理进行更多的探究，比如活性位点可能介导的基本化学反应，从而提高对HAO反应机理的认识。此外，还可以通过对羟胺氧化途径进行复杂的模型研究，确定HAO高效运作的潜在化学反应环境，帮助后续研究者们更快更方便地优化生物脱氮工艺。

(5) 重组基因工程菌已经被广泛用于多个领域，构建出高效表达HAO的重组菌株可能是解决现有生物脱氮体系羟胺积累和保证脱氮系统稳定的重要手段之一。构建高性能的重组菌株通常需要进行多方面的改造，可以通过基因重组法引入具有高活性的外源酶基因以提高菌株HAO的活性，或者通过基因工程的方法在HAO基因前插入调节性的启动子来调节HAO的表达量，或者通过基因编辑技术对HAO的基因序列进行改造，提高其对酶抑制剂或产物抑制的抵抗力。目前许多参与硝化作用的关键酶与标准重组DNA技术不相容，因此，准确、全面分析高活性HAO的结构与功能，结合转录调控分析确定HAO的改造靶点也将是未来更好地利用HAO的研究方向之一。