共聚焦显微镜的常见问题

　　共聚焦显微镜与普通显微镜相比，采用了能到达Zgao分辨率及重复性的无色差扫描技术，能产生真正具有三维清晰度的图像，而且还可以处理活的标本并不对标本造成物理化学特性的破坏。

徕卡 共聚焦显微镜平台 STELLARIS 8

　　1、扫描Z终图像清晰度不高

　　造成此类问题的原因主要有两个：

　　①物镜和ZOOM值选用不正确：

　　初学使用者大多喜欢选用共聚焦显微镜10x物镜后，再将ZOOM值调到所需要的Zda值。通过ZOOM值的增大确实可以将图像放大，有助于看清图像的细节，但是ZOOM的增大是有限定的，这取决于物镜的倍率。例如在10x物镜下，ZOOM值超过10就没有意义了，而且ZOOM值的增大属于电子放大，放大倍数越高，清晰度越差。所以在所观察的样本形态体积较小的情况下，多采用高倍物镜(例如63x水镜或油镜)，再适当调整ZOOM值，ZOOM值Z好不超过2。

　　②误将Z-Position旋转球的功能和共聚焦显微镜焦距微调旋转器的功能等同：

　　在准确调焦的基础上，通过Z-Position旋转球的左右调节，可以观察到目标样品图像由Z轴距离变化而引起的图像清晰度的改变，感觉上和通过调焦使图像变清晰一样。因此很多使用者在没有调焦准确的情况下，直接使用-Position旋转球来调整图像清晰度而导致成像模糊。

　　2、扫描背景强，图像质量差

　　解决这个问题的关键在于要根据样品的制备质量选取合适的针孔大小，调整激光管电压、光电倍增管功率、信噪比等参数到Z佳状态。这些参数或设置有非常密切的关系，选择时应该综合考虑。

　　还有一种明场出现环状波纹背景的情况是由于操作者在使用共聚焦显微镜观察荧光样品后，没有将荧光滤镜退出并切换到扫描状态所致。此时只需要转动调节轮至Scan即可。

　　3、串色

　　在使用多种荧光染料标记样品时或是样品本身有很强的自发荧光时，串色的现象就很容易发生。串色又分为两种情况：

　　①两种荧光染料的激发光谱没有重叠，但是吸收光谱有重叠。这类串色可以通过顺序扫描(又称序列扫描)来完成：即先使用一种荧光染料的激发光扫描一张图片，再使用另外一种荧光染料的激发光扫描第二张图片。

　　②两种荧光染料的激发光谱和吸收光谱都有重迭，这种情况只能通过光谱扫描解决。

　　4、多荧光通道扫描图像的保存及标尺数值的取整

　　在多通道扫描图像存盘时，共聚焦显微镜系统默认以不同单通道的颜色分别保存。为了便于直观的观察各种荧光在不同部位的表达，我们还需要一张各种荧光叠加的合并图像，此时点击Overlay键即可。在单次扫描图像完成后，共聚焦显微镜系统自动生成的标尺数值多数情况下为非整数，即使在图像保存前修改为整数，但一经后续扫描，前幅图像中修改过的标尺数值又会恢复到默认的非整数值。

　　解决这个问题也需要用到Overlay能键，即在单次扫描完成并将标尺数值修改取整后，点击Overlay键显示合并图像，再右键点击选中图片，使之生成Snapshot图像即可。这两点是初学使用者很容易忽视的。

　　5、在图像扫描完成后，各种参数忘记复位

　　特别是电子放大扫描以后，很多操作者都忘记将共聚焦显微镜ZOOM还原，这就造成在下一个样品扫描时无法在显示屏上观察到目标样本。

　　共聚焦显微镜是一种集激光技术、显微镜技术、光度技术、计算机及图像处理技术、精密的机械技术等多种高技术于一身的大型仪器。其价格昂贵，在使用过程中要特别注意做好保养和管理工作。通常要做到以下几点：

　　1、严格按照共聚焦显微镜操作规则使用，避免因使用不当造成损坏。

　　2、为保持良好工作状态，延长使用寿命，工作环境应保持清洁、干燥、远离辐射源。共聚焦显微镜每次使用后，要做好清洁工作，及时清洁目镜、物镜等容易污染的光学部件。

　　3、共聚焦显微镜系统应设立专门房间，安装在防震台上，工作间内要安装空调，抽湿及防尘装置。无论仪器是否工作，Z好使其环境始终保持在22℃±1℃的恒温。

　　4、注意保护仪器的光纤，防止被挤压，仪器常用的零配件及专用工具由专门人员负责保管。

　　5、共聚焦显微镜工作间必须常年保持清洁、卫生，操作人员必须穿拖鞋、工作服。

　　6、使用者必须培训合格后，在管理人员的指导下，方可使用共聚焦显微镜。

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