一种直扩RPA现场可视化检测方法与流程

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及可用于所有基因检测的直扩rpa现场可视化检测方法，还涉及用于检测转基因玉米tc1507和金黄色葡萄球菌的直扩rpa现场可视化检测方法。

背景技术：

目前，涉及到基因检测，传统的分子诊断方法主要有pcr、实时荧光定量pcr、基因芯片和环介导等温扩增方法(lamp)，重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplification，rpa)。rpa是一种新型的等温扩增技术，其主要原理为利用重组酶和引物形成微丝在模板dna上搜索到与之完全互补配对的序列时，在单链dna结合蛋白的帮助下使模板dna解链，引物与模板dna开始配对，并在dna聚合酶的作用下复制延伸。自2006年问世后，已应用于农业、食品安全、医学和转基因检测等多个领域。

现有的rpa检测方法虽然应用广泛，但是仍然存在一些缺陷，其中，最主要的表现在对于产物的检测方面。rpa与琼脂糖凝胶电泳结合，rpa扩增产物检测时，为了避免体系其他成分对电泳的影响例如产生拖带，需要对扩增产物进行纯化，去掉引物、酶等干扰检测的成分。与exo探针结合的实时荧光定量rpa技术，在结果检测时需要使用荧光检测仪。与nfo探针结合的rpa-lfd检测技术，在结果检测时需要使用侧流试纸条，并且rpa扩增产物需要稀释才能使用该方法检测，否认反应底物对试纸上抗体会造成干扰。rpa与染料法结合，rpa产物检测是使用sybrgreenⅰ染料对rpa产生的dna双链进行染色，以此实现对结果的可视化观察，具体是对扩增产物双倍稀释后，在紫外手电筒的帮助下，通过肉眼观察结果。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种直扩rpa现场可视化检测方法，应用于来源于动物、植物、微生物的所有基因进行rpa检测，对rpa扩增产物实现快速、简便、可视化鉴定。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：

一种直扩rpa现场可视化检测方法，其包括如下步骤：

1)粗提待测样品的基因组dna；

2)针对目的基因设计用于rpa检测的特异性引物，所述rpa特异性引物包括外引物f和内引物r；

3)将步骤1)粗提的基因组dna作为模板，步骤2)设计的rpa特异性引物加入到rpa反应体系中，进行rpa扩增反应：

以ddh2o为阴性对照，以含有目的片段的待测样品基因组dna为阳性，配制rpa反应体系：所述rpa反应体系包含外引物f、内引物r、dntps、mgoac(醋酸镁)、模板dna，其中，成分的终浓度为：外引物f0.12-0.48μm，内引物r0.12-0.48μm，dntps1.4-1.8mm，mgoac8.4-14mm，模板dna1～2μl；

rpa扩增反应的程序为：32-42℃，5-10min；

4)鉴定扩增结果

步骤3)rpa扩增反应结束后，向扩增产物中加入sybrgreeni染料，直接在日光灯或者阳光下观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性；显色为橘色的样品为阴性。

进一步，所述粗提待测样品基因组dna的方法包括：向待测样品中加入粗提试剂对待测样品进行5～10倍稀释，混匀，室温放置1min以上，即可作为待测样品模板使用；所述粗提试剂lysisbuffer包含naoh、na2edta，naoh与na2edta的物质的量浓度之比为：48～52：1。

本发明所述rpa反应体系还包含2×reactionbuffer(反应缓冲液)、10×basice-mix(基本酶混合液)、20×corereactionmix(核心反应混合液)。

优选的，步骤3)中，所述rpa反应体系(50μl)中各成分的终浓度为：f0.24-0.48μm，r0.24-0.48μm，2×reactionbuffer25μl，dntps1.4-1.6mm，10×basice-mix5μl，20×corereactionmix2.5μl和mgoac11.2-14mm，模板dna1～2μl。

优选的，步骤3)中，所述rpa扩增反应程序中反应温度为36-42℃。

本发明提供的直扩rpa现场可视化检测方法适用于检测来源于动物、植物、微生物的所有基因，例如，可用于检测待测样品中是否含有玉米、大豆、水稻、油菜、转基因玉米、转基因大豆、转基因水稻、转基因油菜等成分；待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、变形杆菌、志贺氏菌、克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、腊样芽孢杆菌、炎链球菌、单核增生李斯特氏菌、致病性大肠杆菌、肉毒梭菌等。

本发明还提供一种直扩rpa现场可视化检测试剂盒，其包含rpa反应体系，所述rpa反应体系中成分的终浓度为：正向引物f0.12-0.48μm，反向引物r0.12-0.48μm，dntps1.4-1.8mm，mgoac8.4-14mm。

进一步，所述直扩rpa现场可视化检测试剂盒中rpa反应体系还包含2×reactionbuffer、10×basice-mix、20×corereactionmix。

本发明还提供一种用于直扩rpa方法检测转基因玉米tc1507的rpa特异性引物，包括外引物f和内引物r，具体序列如下，从5’端到3’端：

外引物f：aaaagtgcgacaaaagcctccaagcgagtatt；

内引物r：tgacttaatcgcacccatcaggcctttgcagc。

一种检测转基因玉米tc1507的直扩rpa现场可视化检测方法，其包括如下步骤：

1)粗提待测样品基因组dna

2)设计rpa特异性引物

rpa特异性引物包括外引物f和内引物r，具体序列如下，从5’端到3’端：

外引物f：aaaagtgcgacaaaagcctccaagcgagtatt；

内引物r：tgacttaatcgcacccatcaggcctttgcagc；

3)将步骤2)设计的rpa特异性引物加入到rpa反应体系中，进行rpa扩增反应；

以ddh2o为阴性对照，以包含待测样品基因组dna为阳性(待测样品目的序列的基因组为阳性)，配制rpa反应体系；

所述rpa反应体系中成分的终浓度为：外引物f0.12-0.48μm，内引物r0.12-0.48μm，dntps1.4-1.8mm，mgoac8.4-14mm，模板dna1～2μl；

rpa扩增反应的程序为：36-42℃，5-10min；

4)鉴定扩增结果

步骤3)rpa扩增反应结束后，向扩增产物中加入sybrgreeni染料，直接在日光灯或者阳光下观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性，含有转基因玉米tc1507基因组dna；显色为橘色的样品为阴性，不含有转基因玉米tc1507基因组dna。

进一步，步骤1)中，粗提待测样品基因组dna的方法为：向待测样品中加入粗提试剂，混匀，室温放置1min以上，即可作为待测样品模板使用；待测样品与粗提试剂lysisbuffer的质量体积比为：0.5～1：1×104，单位：g/μl；所述粗提试剂lysisbuffer包含naoh、na2edta，naoh与na2edta的物质的量浓度之比为48～52：1。

步骤3)中，所述rpa反应体系还包含2×reactionbuffer、10×basice-mix、20×corereactionmix。

优选的，上述步骤3)中，所述rpa反应体系(50μl)中各成分的终浓度为：f0.24-0.48μm，r0.24-0.48μm，2×reactionbuffer25μl，dntps1.4-1.6mm，10×basice-mix5μl，20×corereactionmix2.5μl和mgoac11.2-14mm，模板dna1～2μl。

优选的，步骤3)中，所述rpa扩增反应程序中反应温度为36-42℃。

本发明还提供一种用于直扩rpa方法检测金黄色葡萄球菌的rpa特异性引物，包括外引物f和内引物r，具体序列如下，从5’端到3’端：

外引物f：atgaatcagctccacagagtacagatgcaagta；

内引物r：ctccagagtcaataccaactgtcacattcgtca。

一种检测金黄色葡萄球菌的直扩rpa现场可视化检测方法，其包括如下步骤：

1)粗提待测样品基因组dna

2)设计rpa特异性引物

rpa特异性引物包括外引物f和内引物r，具体序列如下，从5’端到3’端：

外引物f：atgaatcagctccacagagtacagatgcaagta；

内引物r：ctccagagtcaataccaactgtcacattcgtca；

3)将步骤2)设计的rpa特异性引物加入到rpa反应体系中，进行rpa扩增反应；

以ddh2o为阴性对照，以包含待测样品基因组dna为阳性(待测样品目的序列的基因组为阳性)，配制rpa反应体系；

所述rpa反应体系中成分的终浓度为：外引物f0.12-0.48μm，内引物r0.12-0.48μm，dntps1.4-1.8mm，mgoac8.4-14mm，模板dna1～2μl；

rpa扩增反应的程序为：32-42℃，5-10min；

4)鉴定扩增结果

步骤3)rpa扩增反应结束后，向扩增产物中加入sybrgreeni染料，直接在日光灯或者阳光下观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性，含有金黄色葡萄球菌基因组dna；显色为橘色的样品为阴性，不含有金黄色葡萄球菌基因组dna。

进一步，步骤1)中，所述粗提待测样品基因组dna包括如下步骤：将待测样品切碎后加灭菌的生理盐水得到浆液，向浆液中加入粗提试剂，混匀，室温放置1min以上，即可作为待测样品模板使用；其中，待测样品与生理盐水的质量体积比为1：1～9，单位：g/μl；浆液与粗提试剂的体积比为：1:4～9；所述粗提试剂lysisbuffer包含naoh、na2edta，naoh与na2edta的物质的量浓度之比为48～52：1。

再，步骤3)中，所述rpa反应体系还包含2×reactionbuffer、10×basice-mix、20×corereactionmix。

优选的，步骤3)中，所述的50μl的rpa反应体系中，各成分的终浓度为：外引物f0.12-0.48μm，内引物r0.12-0.48μm，2×reactionbuffer25μl，dntps1.4-1.8mm，10×basice-mix5μl，20×corereactionmix2.5μl和mgoac8.4-14mm，模板基因组dna1～2μl。

更优选的，所述的50μl的rpa反应体系中，各成分的终浓度为：f0.24-0.48μm，r0.24-0.48μm，2×reactionbuffer25μl，dntps1.4-1.6mm，10×basice-mix5μl，20×corereactionmix2.5μl和mgoac11.2-14mm，模板基因组dna1～2μl。

优选的，步骤3)中，所述rpa扩增反应程序中反应温度为36-42℃。

本发明对rpa反应体系中的引物浓度、mgoac浓度、dntps浓度和反应程序中反应温度、反应时间进行了改进。改进后的rpa反应体系和反应程序适用于所有基因的rpa检测。因此，在检测不同基因时，可根据待测样品和检测目的不同进行特异性rpa引物设计，然后使用本发明的直扩rpa快速即时可视化检测方法进行检测。

本发明所述rpa反应体系中内、外引物浓度为0.24-0.48μm，dntps浓度范围为1.4-1.8mm，mgoac浓度范围为8.4-14mm，rpa扩增反应时退火温度范围为：32-42℃，反应时间范围为5-10min。在上述反应体系和反应程序下进行扩增，使用凝胶电泳法可检测出明显的阳性目的条带，即目的条带单一、无杂带，且目的条带更宽更亮更清晰，易与阴性条带区分开来，并且在扩增产物中加入染料后，阳性样品颜色变化明显为绿色且亮度更明显，而阴性样品仍为橘色。

本发明提供的检测方法可在恒温条件下(32～42℃，优选36～42℃)实现对核酸的快速、特异性扩增，且在5～10min内可将核酸扩增至可检测水平，具有良好的操作性，可在非实验条件下完成核酸检测，具有广阔的应用前景。

本发明提供的rpa反应体系可制备成相应的试剂盒，方便使用。

本发明基于对rpa反应体系和反应程序的上述改进，对rpa反应体系中模板dna的纯度要求大大降低，通过待测样品与粗提试剂反应1min以上(实际操作中，反应1min即可获得非常好的rpa扩增效果)，再稀释5-10倍即可作为模板使用，省去提取基因组这一步骤，不仅节约时间，还简化步骤，避免污染，节省成本，这是本发明的一个显著进步。

在结果判定方面，由于现有技术必须将rpa扩增产物进行纯化或稀释后加染料。但纯化或稀释后扩增产物浓度降低，就需要紫外线照射才能观察到显色，既增加了实验操作步骤，又增加了仪器设备，还会对产物带来不同程度的污染。

本发明利用改进后的rpa反应体系和程序得到的扩增产物杂质少、没有经过稀释，纯度高，达到可直接显色的要求，因此，本发明直接在扩增产物中加染料进行显色观察，且显色结果明亮、清晰，可在日光灯或者阳光下直接观察到。可见，本发明无需对扩增反应产物进行纯化或稀释，减少了产物污染的几率；不用多余的显色试剂盒(如侧流层析)，不借助紫外手电筒等，无需任何仪器设备，固本发明简化了结果判定步骤，节约了时间，减少了成本，实现了反应结果的可视化、易判定，可应用于现场检测，达到快速、即时、免仪器显色的特点。

本发明在上述这些方面的改进真正使rpa检测做到了无仪器，快速，可视化。因此，本发明中直扩rpa现场可视化检测在非实验室条件也能检测，尤其是放牧场，种植基地，基层兽医站，养殖场和偏远地区等实验条件简陋的地方。

本发明提供的直扩rpa现场可视化检测方法，首先，通过直扩试剂粗提基因组用于rpa实验，整个粗提过程1～2min可完成；整个rpa扩增反应约5-10min且能达到指数级的扩增并且能检测出产物；最后在rpa扩增产物中加显色剂，在日光灯或阳光下可快速、直接观察到实验结果，整个过程约6-15min即可完成，这在现场检测中很大程度上做到简单、快速、灵敏有效，真正达到快速、可视化、现场检测的目的。

与现有技术对比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的rpa-染色检测法具有如下优势：(1)rpa反应利用人体体温就可以完成反应，即在腋下或者握在拳头里就能实现rpa扩增，rpa反应不需要仪器；(2)扩增产物不需要后续的稀释或者纯化，可直接与染料反应在日光灯或者阳光下进行显色观察。这些改进在操作上节约了时间，节省了试剂，简化了实验步骤。

由于利用粗提试剂对基因组进行粗提得到的基因组中dna不纯，杂质较多，无法满足现有rpa扩增要求。本发明提供的检测方法可直接用粗提基因组进行扩增，使本发明的rpa技术更简单化，更适用于样品的现场检测，尤其是在放牧场、种植基地、基层兽医站、养殖场和偏远地区等，这在操作上降低了成本，节约时间，易于推广。同时该检测方法在保证高灵敏、高特异性的同时，操作简单、耗时短，在常温(32-42℃)下5-10min内对靶dna进行扩增，可实现快速可视化现场检测这一目的，使得在非实验室条件下进行核酸扩增检测成为现实，适用于兽医、食品安全、生物防御、农业等领域的快速诊断，适用于仪器设备较为简陋的地方，适合大范围推广应用。

本发明提供的直扩rpa现场可视化检测方法用于检测转基因成分时检测限为模板浓度0.1％，因此，使用本发明方法检测食品时，如果扩增产物显色为绿色，则该食品中含有转基因成分。

本发明设计的用于检测转基因玉米tc1507的rpa特异性引物，包括外引物f：aaaagtgcgacaaaagcctccaagcgagtatt；内引物r：tgacttaatcgcacccatcaggcctttgcagc。该引物特异性强，与其他转基因作物、非转基因作物都无交叉反应，不会产生交叉感染，灵敏度高，可在模板浓度为0.1％和0.01ng/μl时扩增，非常适用用于rpa检测转基因玉米tc1507。

本发明设计的用于检测金黄色葡萄球菌的rpa特异性引物包括：外引物f：atgaatcagctccacagagtacagatgcaagta；内引物r：ctccagagtcaataccaactgtcacattcgtca。该引物特异性强，与其他病原微生物都无交叉反应，不会产生交叉感染，灵敏度高，可在模板浓度的检测限为101cfu/ml时扩增，非常适用用于rpa检测食源性病原微生物。

本发明提供的rpa检测方法特异性好，灵敏度高，例如选用两种典型的实例进行了特异性和灵敏度检测，具体是：在对转基因玉米tc1507的诊断中，可在转基因成分质量为0.1％和基因组浓度为0.01ng/μl下进行扩增；对食源性病原微生物金黄色葡萄球菌的诊断中，检测限约为101cfu/ml。因此，本发明所述直扩rpa现场可视化检测方法具有普适性，可应用于来源于动物、植物、微生物的所有基因检测，并具有反应条件简单、操作简便快速、灵敏度高、结果判定方便、准确等优点。

附图说明

图1为本发明实施例2中rpa引物筛选电泳结果示意图。

图2为本发明实施例3中rpa可视化结果示意图。

图3为本发明实施例3中rpa电泳结果示意图。

图4为本发明实施例4中不同含量的基因组dna进行rpa灵敏度检测的电泳结果示意图。

图5为本发明实施例4中不同含量的基因组dna进行rpa灵敏度检测的可视化结果示意图。

图6为本发明实施例4中不同含量的基因组dna进行pcr灵敏度检测的电泳结果示意图。

图7为本发明实施例4中不同浓度的基因组dna进行rpa灵敏度检测的电泳结果示意图。

图8为本发明实施例4中不同浓度的基因组dna进行rpa灵敏度检测的可视化结果示意图。

图9为本发明实施例4中不同浓度的基因组dna进行pcr灵敏度检测的电泳结果示意图。

图10为本发明实施例5中rpa特异性电泳结果示意图。

图11为本发明实施例5中rpa特异性可视化结果示意图。

图12为本发明实施例6中模拟样品检测rpa灵敏度电泳结果示意图。

图13为本发明实施例6中模拟样品检测rpa灵敏度可视化示意图。

图14为本发明实施例8中rpa可视化结果示意图

图15为本发明实施例8中rpa电泳结果示意图

图16为本发明实施例9中rpa灵敏度电泳结果示意图。

图17为本发明实施例9中rpa灵敏度可视化结果示意图。

图18为本发明实施例9中rpa特异性电泳结果示意图。

图19为本发明实施例9中rpa特异性可视化结果示意图。

图20为本发明实施例9中模拟样品检测rpa灵敏度电泳结果示意图。

图21为本发明实施例9中模拟样品检测rpa灵敏度可视化结果示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。

实施例(一)

实施例1用于检测转基因玉米tc1507的rpa引物组的获得

根据gmdd(gmodetectionmethoddatabase)中找到转基因玉米tc1507的保守序列进行引物设计，由于rpa技术发展的不成熟，故而不像pcr或者lamp那样有专门设计引物的软件，因此，rpa的引物设计需要人工手动设计，进一步在实验中验证，筛选出最合适的引物对。

在设计rpa引物时，需要遵循的如下原则：

1)引物长30-35bp，引物的长度影响重组酶的活性，引物过短会降低重组酶效率，长引物可以用来扩增，有试验证明45bp的引物也可以使用，但引物过长会增加引物二级结构形成的可能性，不一定会增加效率；

2)gc含量在40-60％，其中，引物的5’端的3-5个核苷酸中存在胞嘧啶有助于片段重组，应尽量避免聚鸟嘌呤，3’末端的3个核苷酸中存在鸟嘌呤和胞嘧啶更有助于聚合酶的结合稳定性，提高引物扩增性能；

3)应当尽量避免形成二级结构：引物-探针互作、引物二聚体、发夹结构等；

4)应避免出现长串的重复序列。设计探针应当注意：避免形成引物-探针互作，特别是标记引物与探针发生反应会造成结果的假阳性。然而，长引物和长探针的设计要求必然会增加引物、探针设计的难度，相对于pcr、lamp来说，更易形成引物-引物、引物-探针互作。

tc1507保守序列的具体序列如下：

1：gaaggagtcaaaccactcctccgaggcctcgggggctacacccggcgggt；

51：gcgctcgcgcgcacccaccggaacaaaatgtaaccgagaaaggtcggtcc

101：ccttgcaaaaaaagtgcgacaaaagcctccaagcgagtattaacactcac；

151：tttgaggctcgggggctactgtcggggaccataattaggggtacccccaa；

201：gactcctaatctcagctggtaacccccatcagcacaaagctgcaaaggcc；

251：tgatgggtgcgattaagtcaaggctcggtccactcaagggacacgatctc；

301：gcctcgcccgagcccagcctcgggcaagggcggccgaccccgaggattca；

351：cgtctcgcccgagggccccctcaagcgacgggcacaccttcggctcgccc；

401：gaggcccattcttcgccgagaagcaaccttggccagatcgccacaccgac；

451：cgaccgtatcgcaggagcatttaatgcgaggatcgcctgacaccttatcc。

设计的转基因玉米tc1507特异性引物组序列如下：

t6-faagtgcgacaaaagcctccaagcgagtatta；

t6-rgacttaatcgcacccatcaggcctttgcagc。

t9-faaaagtgcgacaaaagcctccaagcgagtatt；

t9-racttaatcgcacccatcaggcctttgcagctt。

t10-f：aaaagtgcgacaaaagcctccaagcgagtatt；

t10-r：tgacttaatcgcacccatcaggcctttgcagc。

实施例2rpa引物筛选

本实施例将设计的三对tc1507的引物，按照twistdxliquidbasickit的说明书进行实验，并筛选出一对扩增出较好的目的条带的引物组。

配制rpa反应体系：ddh2o0.2μl，浓度10μm的引物f/r2.4μl，2×reactionbuffer25μl，浓度10mm的dntps9μl，10×basice-mix5μl，20×corereactionmix2.5μl和浓度280mm的mgoac2.5μl，提取的基因组dna1μl。

rpa反应程序为：37℃，20min。

rpa结果采用琼脂糖凝胶电泳法进行检测，t6、t9和t10目的片段长度分别为158bp，159bp，161bp。检测结果如图1所示，t6，t9和t10分别是转基因玉米tc1507的不同引物的样品，n6、n9和n10分别是转基因玉米tc1507的不同引物的阴性对照。图1表明，t10的目的条带和阴性对照效果较好，故筛选出来tc1507的特异性引物组为t10。

实施例3

1)使用dna提取试剂盒(上海博满生物科技有限公司)，并参照试剂盒说明书，提取转基因玉米tc1507基因组dna。

2)配制rpa反应体系

设置阴性对照(ddh2o)体系，以包含转基因玉米tc1507目的序列的基因组为阳性，配制rpa反应体系，设置阴性对照以证明反应体系未被其他基因组污染，达到辨别阳性样品的目的，验证测定结果的正确性。

为防止实验出现假阳性结果，配制rpa反应体系和对照体系时，进行分区操作。

配制反应体系时，不添加模板，先将外引物f、内引物r、2×reactionbuffer、dntps，10×basice-mix配制好并混匀，再在管盖上加入20×corereactionmix，混匀并分装分成两组，分别加入阴性对照(ddh2o)和待测样品(tc1507)基因组dna，加入阴性对照的成为阴性对照体系，加入待测样品(tc1507)基因组dna的成为反应体系，再分别在两组的管盖上加入mgoac，将各体系的混合物涡旋混匀、瞬离，放入pcr仪中37℃保温5min。

50μl的rpa反应体系中包括：ddh2o3.4μl，浓度10μm的引物t10f/r各1.8μl，2×reactionbuffer25μl，浓度10mm的dntps7μl，10×basice-mix5μl，20×corereactionmix2.5μl和浓度280mm的mgoac2.5μl，提取的基因组dna1μl。

3)进行rpa扩增反应

配制好反应体系后进行rpa扩增反应，反应程序为：37℃5min；

4)鉴定扩增结果

步骤3)rpa扩增反应结束后，直接向扩增产物中加入sybrgreeni染料(50×)3μl，观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性，含有转基因玉米tc1507基因组dna；显色为橘色的样品为阴性，不含转基因玉米tc1507基因组dna，结果参见图2，其中t为转基因玉米tc1507，n为阴性对照。图2中，t显示绿色，n显示橙色。

或者将rpa产物用axygen纯化试剂盒进行纯化，取纯化后的产物5μl在goldview染色的2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，然后在凝胶成像仪器的紫外光下显影观察，出现目的条带的样品为阳性，含有转基因玉米tc1507基因组dna；无目的条带出现的样品为阴性，不含转基因玉米tc1507基因组dna，结果参见图3，其中t为转基因玉米tc1507，n为阴性对照。由图3可知，样品t显示目的条带161bp。

由图2-3可以看出，电泳结果和显色结果的阴性对照(n)均表现为阴性结果，检测样品(t)均表现为阳性结果，可见，本实施例提供的rpa可视化快速检测结果与电泳结果一致。因此，本发明提供的引物、rpa反应体系、反应时间均可用于检测转基因玉米tc1507。

实施例4灵敏度验证

本实施例将提取的转基因玉米tc1507(转基因含量为10％)稀释到5％，1％，0.5％，0.1％，0.01％，分别进行rpa和pcr检测方法的灵敏度进行测试。

将提取的转基因玉米tc1507进行浓度测定，把浓度调整到5ng/μl，1ng/μl，0.5ng/μl，0.1ng/μl，0.01ng/μl，0.001ng/μl，分别进行rpa和pcr检测方法的灵敏度进行测试。

rpa反应体系：ddh2o3.4μl，浓度10μm的外引物t10f、内引物t10r各1.8μl，2×reactionbuffer25μl，浓度10mm的dntps7μl，10×basice-mix5μl，20×corereactionmix2.5μl和浓度280mm的mgoac2.5μl，基因组dna1μl。rpa反应程序为：37℃，5min。

pcr反应体系：ddh2o17μl，浓度2.5mm的1×dntps2.0μl，10×buffer(含mg2+)2.5μl，浓度10μm的外引物f1.0μl，浓度10μm的内引物r1.0μl，提取的tc1507的dna1μl，5u/μl的taqdna聚合酶0.5μl。pcr反应程序为：95℃预变性10min，进入pcr反应循环：95℃变性60s，87℃退火40s，72℃延伸35s，共进行35个循环，72℃总延伸7min。

rpa结果判定方法参见实施例2，电泳结果和显色结果分别如图4、图5，图7、图8所示，pcr结果采用琼脂糖凝胶电泳法进行检测，目的片段长为161bp，检测结果如图6、图9所示。

其中，图4-图6中模板含量分别为5％，1％，0.5％，0.1％，0.01％，即1为5％的tc1507基因组dna，2为1％的tc1507基因组dna，3为0.5％的tc1507基因组dna，4为0.1％的tc1507基因组dna，5为0.01％的tc1507基因组dna，n为阴性对照。图6中，1-4均显示绿色，5及阴性对照(n)显示橙色。

图7-图9模板浓度分别为5ng/μl，1ng/μl，0.5ng/μl，0.1ng/μl，0.01ng/μl，0.001ng/μl，即1为5ng/μl浓度的tc1507基因组dna，2为1ng/μl浓度的tc1507基因组dna，3为0.5ng/μl浓度的tc1507基因组dna，4为0.1ng/μl浓度的tc1507基因组dna，5为0.01ng/μl浓度的tc1507基因组dna，6为0.001ng/μl浓度的tc1507基因组dna，n为阴性对照。图11中，1-5均显示绿色，6及阴性对照(n)显示橙色。

由图4、图5结果表明：本发明的rpa检测限是0.1％，由图6结果表明：pcr的检测限是0.1％。

由图7、图8结果表明：本发明的rpa检测限是0.01ng/μl，图9结果表明：pcr的检测限是0.01ng/μl。

由此可知，本发明提供的rpa检测方法和pcr灵敏度基本相同，同时可以看出，转基因tc1507的rpa可视化快速检测方法与电泳结果一致。

实施例5特异性验证

本实施例为验证筛选出来的转基因玉米tc1507引物t10的特异性，进行的rpa扩增反应。模板分别为转基因玉米tc1507，bt176，ga21，非转基因玉米，大豆，油菜籽，小麦和棉花。

本实施例rpa反应体系为：ddh2o3.4μl，浓度10μm的引物t10f/r各1.8μl，2×reactionbuffer25μl，浓度10mm的dntps7μl，10×basice-mix5μl，20×corereactionmix2.5μl和浓度280mm的mgoac2.5μl，转基因玉米tc1507基因组dna1μl。rpa反应程序为：37℃，5min。

rpa结果判定方法参见实施例2，电泳结果参见图10和显色结果参见图11，其中，1为转基因玉米tc1507基因组dna，2为转基因玉米bt176基因组dna，3为转基因玉米ga21基因组dna，4为非转基因玉米基因组dna，5为大豆基因组dna，6为油菜籽基因组dna，7为小麦基因组dna，8为棉花基因组dna，n为阴性对照基因组dna。图11中，1显示绿色，2-8及阴性对照(n)显示橙色。

由图10-11结果表明：转基因玉米tc1507表现为阳性结果，阴性对照(n)和其他样品均表现为阴性结果。因此，本发明转基因玉米tc1507的rpa可视化快速检测的特异性好，不与其他作物产生交叉感染。同时说明加入荧光染料后，可视化结果与电泳结果一致。

实施例6模拟样品检测

本实施例为验证本发明的实际应用性，实验中人工配制6个模拟样品，样品1-6转基因玉米tc1507含转基因成分分别是10％，5％，1％，0.5％，0.1％，0.01％。其中，样品1、2的制备是通过将转基因玉米tc1507与转基因玉米bt176、nk603相混合。样品3、4的制备是通过将转基因玉米tc1507与非转基因玉米相混合。样品5、6的制备是通过将转基因玉米tc1507与非转基因大豆、水稻相混合。

模拟样品1-6均应用粗提试剂(lysisbuffer(0.5mnaoh，10mmna2edta))抽提基因组dna。具体粗提步骤如下：

1)称量样品粉末0.02g；

2)加入粗提试剂lysisbuffer200μl；

3)剧烈混匀5s，室温放置1min；

4)加无菌水对步骤3)的液体进行5倍稀释，即可作为待测样品模板使用。

本实施例rpa反应体系为：ddh2o3.4μl，浓度10um的引物t10外引物f、内引物r各1.8μl，2×reactionbuffer25μl，浓度10mm的dntps7μl，10×basice-mix5μl，20×corereactionmix2.5μl和浓度280mm的mgoac2.5μl，模板dna1μl。rpa反应程序为：37℃，5min。

rpa结果判定方法参见实施例2，电泳结果参见图12和显色结果参见图13，其中，1为样品1，2为样品2，3为样品3，4为样品4，5为样品5，6为样品6，n为阴性对照。

由图12可知，1-5均显示目的条带161bp。

图13中，1-5显示绿色，6显示橙色，n显示橙色。

图12-13结果表明：rpa的检测限为0.1％，与实施例4的灵敏度检测限一致，也说明，tc1507的rpa可视化快速检测与电泳结果一致。

实施例(二)

本实施例将本发明的rpa检测方法应用于食源性病原微生物金黄色葡萄球菌的检测中。

实施例7用于检测食源性病原微生物金黄色葡萄球菌的rpa引物组的获得

从ncbi中找到金黄色葡萄球菌(登录号：jq278707.1)的特异性序列，使用软件primerpremier5.0，根据rpa引物设计原则进行引物设计，并对其进行合成，完成一系列的引物筛选。

金黄色葡萄球菌的特异性序列如下：

1：aaatccagcacaacaggaaacgacacaatcagcatcaacaaatgcaacta；

51cagaagaaacaccggtaactggtgaagttactactacggcaacgaatcaa；

101gctaatacaccggcaacaac

tcaatcaagcaatacaaatgcggaaaaatc；

151agtgaatcaaacaagtaatgaaacgacttctaatgatactaatacagtat；

201catctgtaaattcacctcaaaattctacaaatgcggaaaatgtttcaaca；

251acgcaagatacttcaactgaagcaaaaccttcaaacaatgaatcagctcc；

301acagagtacagatgcaagtaataaagatgtagttaatcaagcggttaata；

351caagtgcgcctagaatgagagcatttagtttagcggctgtagctgcagat；

401gcaccggctgctggcacagatattacgaatcagttgacgaatgtgacagt；

451tggtattgactctggagatacagtttatccgcaccaagcaggctatgtca；

501aactgaattatgggttctcagtacccaattctgcggttcaaggtgacaca；

551tttaaaataactgtacctaaagaattaaacttaaatggtgtaacctcaac；

601tgctaaagtgccaccaattatggccggagat。

设计金黄色葡萄球菌的引物序列如下：

s1-fcagctccacagagtacagatgcaagtaataaag；

s1-rctccagagtcaataccaactgtcacattcgtca。

s3-ftgaatcagctccacagagtacagatgcaagta；

s3-rtccagagtcaataccaactgtcacattcgtca。

s4-fagctccacagagtacagatgcaagtaataaag；

s4-rtccagagtcaataccaactgtcacattcgtca。

s7-f：atgaatcagctccacagagtacagatgcaagta；

s7-r：ctccagagtcaataccaactgtcacattcgtca。

最终筛选出的引物为引物组s7。

实施例8

1)粗提基因组dna

a.取金黄色葡萄球菌菌液20μl；

b.加入粗提试剂lysisbuffer(0.5mnaoh，10mmna2edta)180μl，相当于对金黄色葡萄球菌菌液进行10倍稀释；

c.剧烈混匀5s，室温放置1min。

2)配制rpa反应体系

设置阴性对照(ddh2o)体系，以包含金黄色葡萄球菌目的序列的基因组为阳性，配制rpa反应体系，设置阴性对照以证明反应体系未被其他基因组污染，达到辨别阳性样品的目的，验证测定结果的正确性。

配制反应体系，ddh2o3.4μl，浓度10um的引物s7f/r各1.8μl，2×reactionbuffer25μl，浓度10mm的dntps7μl，10×basice-mix5μl，20×corereactionmix2.5μl和浓度280mm的mgoac2.5μl，基因组dna1μl。

rpa反应程序为：37℃，5min。

rpa结果判定方法参见实施例3，显色结果参见图14和电泳结果参见图15，其中s为黄色葡萄球菌，n为阴性对照。

图14中，s显示绿色，n显示橙色。由图15可知，样品s显示目的条带180bp。

由图14-15可以看出：电泳结果和显色结果的阴性对照(n)均表现为阴性结果，检测样品(s)均表现为阳性结果，可见，本实施例提供的rpa可视化快速检测结果与电泳结果一致。因此，本发明提供的引物、rpa反应体系、反应时间均可用于检测金黄色葡萄球菌。

实施例9灵敏度和特异性验证，并且对其进行模拟现场检测。

本实施例使用实施例8的体系和程序，对其进行特异性和灵敏度验证，并且对其进行模拟现场检测。rpa结果判定方法参见实施例3。

1)在验证灵敏度实验中，金黄色葡萄球菌rpa实验电泳结果参见图16，显色结果图参见17，其中，金黄色葡萄球菌模板浓度分别为105cfu/ml，104cfu/ml，103cfu/ml，102cfu/ml，101cfu/ml，100cfu/ml，即1为105cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌基因组dna，2为104cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌基因组dna，3为103cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌基因组dna，4为102cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌基因组dna，5为101cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌基因组dna，6为100cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌基因组dna，n为阴性对照。其中，模板是用粗提试剂对金黄色葡萄球菌进行粗提，并稀释10倍制备得到。

图16中1-5均扩增出目的条带180bp。图17中1--5均显示绿色，6、n显示橙色。

图16-17表明，金黄色葡萄球菌的检测限都是101cfu/ml，并且其rpa可视化快速检测与电泳结果一致。

2)在验证特异性实验中，金黄色葡萄球菌rpa实验电泳结果参见图18，显色结果参见图19。其中，模板分别是金黄色葡萄球菌，变形杆菌atcc12453，克雷伯杆菌atcc46114，福氏志贺氏菌cmcc51571，铜绿假单胞菌iqcc12625，腊样芽孢杆菌atcc1220，炎链球菌atcc27336，沙门氏菌atcc14028，n为阴性对照。即1为金黄色葡萄球菌，2为变形杆菌atcc12453，3为克雷伯杆菌atcc46114，4为福氏志贺氏菌cmcc51571，5为铜绿假单胞菌iqcc12625，6为腊样芽孢杆菌atcc1220，7为炎链球菌atcc27336，8为沙门氏菌atcc14028，n为阴性对照。其中，模板是用粗提试剂对样品进行粗提，并稀释10倍制备得到。

图18显示样品1扩增出目的条带180bp，样品2-8均没有显示目的条带。图19中样品1显示绿色，其他样品均显示橙色。

图18-19表明：食源性病原微生物金黄色葡萄球菌的引物组s7的特异性特别好，与其他病原微生物无交叉反应，并且其rpa可视化快速检测与电泳结果一致。

3)在验证模拟现场检测实验中，通过验证人工污染猪肉的检出限来进行。

取经国家标准检测证实不含有食源性致病菌(金黄色葡萄球菌)的猪肉25克，切碎后加入225ml灭菌的生理盐水匀浆，制备猪肉匀浆液。

将金黄色葡萄球菌分别接种于lb液体培养基中，在培养箱中37℃，220rpm振荡过夜培养，采用分光光度计进行测定，测出在波长为660时的od值，并换算成菌落数。

取致病菌菌液1ml加入到9ml猪肉匀浆液中，混合后作为污染食品样品原样，用匀浆液作为稀释液进行10倍倍比稀释(用匀浆液进行稀释)，取每个稀释度菌液20μl用粗提试剂(180μl)lysisbuffer(0.5mnaoh，10mmna2edta)提取基因组dna，进行rpa扩增确定金黄色葡萄球菌在猪肉中的检出限。

金黄色葡萄球菌rpa实验电泳结果参见图20，显色结果参见图21，其中，模板浓度分别为103cfu/ml，102cfu/ml，101cfu/ml，100cfu/ml，即1为103cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌基因组dna，2为102cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌基因组dna，3为101cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌基因组dna，4为100cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌基因组dna，n为阴性对照。

图20显示1-3均扩增出目的条带180bp。图21中1-3均显示绿色，4、n显示橙色。

图20-21表明：食源性病原微生物金黄色葡萄球菌的灵敏度很高，能检测出浓度为101cfu/ml的金黄色葡萄球菌，说明本发明rpa方法的重复性也很好。